医学免疫学精品教学（复旦大学）2.对流免疫电泳.pptxVIP

授课老师：汪路曼 助教： 刘婷 医学免疫学实验 2017/03/08—2017/04/12 lumanwang@ 实验室注意事项 准时到达实验室，熟悉本次实验相关的试剂和材料，并做适当的准备。 实验期间要穿实验服，禁止在实验室内吃（喝）东西 实验结束后收拾桌面，物归原处，打扫卫生，收拾垃圾（垃圾扔在走廊西侧垃圾桶内）。 实验室设备和试剂方面的问题可联系411王老师。 显微镜问题联系211室谢老师。 实验室注意事项 女厕在3楼，5楼西侧；男厕在4楼 寄包柜密码仅一次有效，再次寄存需重新启动。非贵重物品建议不要寄存，可放置旁边的架子上。如有问题，联系411室吴老师和李老师。 走廊东侧有饮水机 课程安排 次序 实验 实验一 免疫比浊法检测免疫球蛋白 实验二 对流免疫电泳 实验三 ELISA双抗夹心法检测癌胚抗原 实验四 小鼠脾脏单个核细胞分离 实验五 流式检测小鼠淋巴细胞表面标记  实验六 吞噬细胞功能检测 课程安排 次序 实验 实验一 免疫比浊法检测免疫球蛋白 实验二 对流免疫电泳 实验三 ELISA双抗夹心法检测癌胚抗原 实验四 小鼠脾脏单个核细胞分离 实验五 流式检测小鼠淋巴细胞表面标记  实验六 吞噬细胞功能检测 授课老师：汪路曼 助教： 刘婷 实验二 对流免疫电泳 2017-03-15 实验背景 理论要点， 技术方法 实验步骤 在操作中发现问题， 总结经验 结果分析 判断实验结果的正确性 实验目标 理解原理， 学会操作 实验目标 学习并理解对流免疫电泳 能够理解对流免疫电泳的实验原理，电泳/电渗概念的认识。 2. 掌握该方法的应用 能够完成铺胶—打孔—加样等细节操作。 3. 判断实验结果 能够依据实验结果判断实验是否成功，并总结实验过程中的注意事项。 实验背景 对流免疫电泳(免疫电渗电泳) 1.实验原理 抗原和抗体在双向琼脂扩散与电泳的双重作用下形成抗原-抗体复合物，表现形式为一条乳白色沉淀线。 2.实验元件 抗原/抗体，电场环境（电泳作用），琼脂凝胶（电渗作用） 实验背景 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。 在PH8.6的缓冲液中，抗原（蛋白质）带负电荷，向正极泳动。 抗体因等电点较高，被认为带微弱负电或不带电荷，在电渗力的作用下，向负极移动。 带电颗粒的性质—电荷量越大，分子量越小迁移速度越快 缓冲液中pH值—pH值较pI越大，羧基解离越多，负电荷越多 溶液的离子强度—离子强度越低，迁移速度越快 电场强度—电位差越大，迁移速度越快 吸附作用—介质对蛋白的滞留作用（拖尾） 电渗作用 实验背景 蛋白质是由α-氨基酸通过肽键构成的高分子化合物，在蛋白质分子中存在着氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，蛋白质也是两性物质。 所谓两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能释放出质子的NH3+缬氨酸离子和能接受质子的COO-负离子，因此氨基酸是两性电解质。 实验背景 等电点（protein isoelectric point ，PI）：氨基酸的带电状况取决于所处环境的PH值， 改变PH值可以使氨基酸带正电荷或负电荷，也可使它处于正负电荷数相等， 即净电荷为零的两性离子状态。 使氨基酸所带正负电荷数相等即净电荷为零时的溶液PH值称为该氨基酸的PI。 实验背景 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。 在PH8.6的缓冲液中，抗原（蛋白质）带负电荷，向正极泳动。 抗体因等电点较高，被认为带微弱负电或不带电荷，在电渗力的作用下，向负极移动。 带电颗粒的性质—电荷量越大，分子量越小迁移速度越快 缓冲液中pH值—pH值较pI越大，羧基解离越多，负电荷越多 溶液的离子强度—离子强度越低，迁移速度越快 电场强度—电位差越大，迁移速度越快 吸附作用—介质对蛋白的滞留作用（拖尾） 电渗作用 实验背景 电渗（electroosmosis）是电动现象之一，在电场中液体（主要是水分子）对于一个固定介质的相对移动。 在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正负离子，使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定的方向移动，此种情况称为电渗现象。如在本实验中，琼脂凝胶含有SO42-，电泳时，由于静电作用使周围溶液带正电荷。水分子受到静电感应作用带有正电荷向负极运动，携带着抗体分子而向负极移动。 实验背景 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。 在PH8.6的缓冲液中，抗原（蛋白质）带负电荷，向正极泳动。 抗体因等电点较高，被认为带微弱负电或不带电荷，在电渗力的作用下，向负极移动。 带电颗粒的性质—电荷量越大，分子量越小迁移速度越快 缓冲液中pH值—pH值较pI