医学免疫学精品教学（复旦大学）3.ELISA双抗夹心法检测癌胚抗原.pptxVIP

医学免疫学实验授课老师：汪路曼助教： 刘婷2017/03/08—2017/04/12lumanwang@实验室注意事项准时到达实验室，熟悉本次实验相关的试剂和材料，并做适当的准备。实验期间要穿实验服，禁止在实验室内吃（喝）东西实验结束后收拾桌面，物归原处，打扫卫生，收拾垃圾（垃圾扔在走廊西侧垃圾桶内）。实验室设备和试剂方面的问题可联系411王老师。显微镜问题联系211室谢老师。实验室注意事项女厕在3楼，5楼西侧；男厕在4楼寄包柜密码仅一次有效，再次寄存需重新启动。非贵重物品建议不要寄存，可放置旁边的架子上。如有问题，联系411室吴老师和李老师。走廊东侧有饮水机课程安排次序实验实验一 免疫比浊法检测免疫球蛋白实验二 对流免疫电泳实验三 ELISA双抗夹心法检测癌胚抗原实验四 小鼠脾脏单个核细胞分离实验五 流式检测小鼠淋巴细胞表面标记 实验六 吞噬细胞功能检测课程安排次序实验实验一 免疫比浊法检测免疫球蛋白实验二 对流免疫电泳实验三 ELISA双抗夹心法检测癌胚抗原实验四 小鼠脾脏单个核细胞分离实验五 流式检测小鼠淋巴细胞表面标记 实验六 吞噬细胞功能检测实验三ELISA双抗夹心法检测癌胚抗原授课老师：汪路曼助教： 刘婷2017-03-22实验目标 理解原理，学会操作 实验背景 理论要点， 技术方法实验步骤 在操作中发现问题，总结经验结果分析判断实验结果的正确性实验目标 学习并理解双夹心ELISA方法能够了解双夹心ELISA方法的基本原理和操作步骤，包括几个重要的实验元件，抗原-抗体复合物的概念。2. 掌握该方法的应用注意避免不规则的操作，理解该方法的实验应用和意义。3. 判断实验结果能够依据实验结果判断实验是否成功，并总结实验过程中的注意事项。实验背景 癌胚抗原（CEA）辅助诊断CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。正常人群CEA水平低于5ng/mL。在多种癌症当中（如大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等）可见CEA升高。但CEA升高并不代表患癌，因为吸烟、妊娠期或其他疾病也可以引起CEA升高。所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在临床诊断上只有参考价值。区别良/恶性肿瘤虽然CEA升高无早期诊断价值，但对鉴别良性与恶性肿瘤有重要提示。患者血清中CEA水平与肿瘤进展相关，也可用于术后手术成败的判断。人结肠癌石蜡切片实验背景 ELISA（enzyme-linked?immunosorbent?assay），即酶联免疫吸附测定法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析。竞争法间接法双抗夹心法直接法实验背景 抗体（一抗）的包被CEA抗体（一抗）溶于碳酸盐缓冲液中，被吸附在固相载体（聚苯乙烯等）表面；之后用富含蛋白的封闭液将没有吸附抗体的表面封闭。12抗原-抗体复合物的形成在适当温度及充分反应时间的条件下，样品中游离的抗原会被固相载体表面的抗体捕获。酶标抗体（二抗）的结合带有偶联酶的抗体一方面可以识别并结合CEA抗原的另外抗原决定簇，另外也保持着酶的活性。 433214酶催化底物反应底物经过酶的催化发生肉眼可见颜色的变化，通过测定OD值从而定量CEA抗原。双抗夹心法实验背景 抗体/酶标抗体双夹心法需要两种抗体，应用的原则是该两种抗体都可以与靶抗原发生特异性结合且识别的抗原决定簇不一致。酶—底物ELISA中的酶以辣根过氧化物酶(HRP)常用，发生氧化还原反应（注意及时终止），四甲基联苯胺（TMB）常用作为可视化显色反应的底物，在HRP催化下会产生可溶性蓝色产物，颜色深浅与抗原浓度成正比。终止液稀硫酸是以上体系中常用的终止液，不仅可以使酶失活，终止酶促反应，另外也可以降低PH，发生离子化合物的转变，呈现出黄色，在最大吸收波长450nm测定OD读值。实验材料 1. 待测样品阴性对照，1—5号标准样品（ 5/10/20/40/80ng/ml ），2份待检样品2. 酶微孔反应板包被有CEA抗体3. 洗涤液用蒸馏水稀释成1×4. 酶标抗体含HRP标记的CEA抗体5. 底物显色液A(含过氧化氢)、底物显色液B(含TMB) 6. 终止液稀硫酸7. 移液器、吸水纸、废液缸、37℃孵箱、 酶标仪实验步骤 /immunology/mianyi/index.html实验步骤 实验步骤 /immunology/mianyi/index.html实验步骤 /immunology/mianyi/index.html实验步骤 /immunology/mianyi/index.html实验步骤 /immunology/mi