五个突变位点对大片段Taq+DNA聚合酶聚合功能影响得研究.pdfVIP

前言 1前言 1．1 7研Dl4A聚合酶结构和功能的研究进展 功腊姨聚合酶(93．9KD)是从嗜热菌胁mⅫ呻删豳中分离山来的耐热DNA聚合酶(oi前等， 1卿＆K出商等t I嘶1)技术迅速崛起， 19固0)，该酶茂现约10年后，基丁此酶的PcR(pdMT珏碡d目．m 合酶在结构t屑于I型DNA聚合酶(ONAp0帅ⅫRI)或A族ⅢA聚合酶，该族研蛆聚台酶还包括17 聚合酶区与所有的饼蚺聚合酶都有相同的结构特征，它的形状就像人的右jF一样，由拇指区，掌凸f瓦和 手指I戈组成∞枷铂n等，i002)。学心『；(的功能是催化磷酰基转移反应，手指区的功能则是促进_二磷酸核苷 酸与模版配对反应。拇捌式控常惆琏研蛆的位置移动和子链延伸皿Ⅻ睡誓rI等，1998)。z田刚A聚合酶与 其他A族饼舱聚合酶样，都员有N端的5’核酸外切酶区，和位于C端聚台区、N端5，核酸外切酶区之 间的3’核酸外切酶区。但由丁7函璜qA聚合酶3’核酸外切酶区结构上的变化和多位点氨基酸替换而髭失了 在聚合过程中有错误§刨申倾向。当去掉N端5-3’核酸外切酶区后，3-5’的外切酶活性得±瞧复．而且复制 的准确率是功全酶的两倍(【j等，19噼．Banes等，1092)。在应用方面，大片段功饼姨聚合酶的耐热 性提高，因而更适宜扩增OC含革高和含有，缎结构的模版，其变性温度可达到98℃(bmH等， 100B)；这种耐热性和3，-5’外切功能使它具备了扩增长链的能力，司审L增3锄)以卜的模版(Waym等， 1004)。另外，通过对不同位点的突变以及与其他聚台酶进行大片段变换也可以有效的改善7砷研n聚合 1．1．17幻璜帆聚合酶的结构和作用机制 砌饼蛆聚合全酶包括了N端的5’核酸外切酶医，3’核酸外切酶区，聚合酶区(圈】)。脚饼蛆聚合 酶的聚合醐撼渐f酶的雌f七聚台功能，该区由手指区．掌岖和拇捌式构成。在J型腊姐聚台酶族中，各 醐错黜狮搠学￡，区相同，手袱踏有不同(图2)圆瓣镑1993；陆删镑删k TagDNA聚含博的 催化反应通常是以DNA为底物的催化反应。为保证对DNA的真实拷贝，该酶能够1)tl惕0模板I]XIA； 2)识别与模板相匹配的二二磷酸脱氧核苷酸卿、r卿，并与模板结合；3)催化心fIP与引物的3学}基形成核苷 共价键；4)重复l~3步骤并使子链延伸；5)饼蛆解链不影响酶的活性，片具有持续高温的聚合能力 O州u等，2000)。擎0区含有催化核苷键形成删也位点，核营键在此区形成。模板链研蛆1j相应心肝 的选择及心丌P与模扳的凤桩手指区进行。拇指区使新合成的双链13NA捌顿序沿着酶移动(图3)(Ecm 化确保正确的泖接在引物的3嗜。端。当栅底物与处丁=打开状态的酶D№复台物结台后，聚台酶的 结构发生变化：由开放状态变为闭合状态，从而限制r其它(NIP与酶DNA复合物结合的机会。聚合反应 发生在口恰状态，选中的心ⅡP与引物3’末端结合。在聚合反麻完成后，其结构又发生变化：酶由闭合状 态转为开放状态，焦磷酸的释放和DNA的移f妇够嘞完成，酶准备。F—轮的聚合反麻f图舢(Lj等， 1998：2001)。 东北农业大学农学博+学位论文 ■●●|目豳III—— I■——瞄■—■—■■■■■●●■■■■■■■■■■|皇 图1-1．ragCt,】A聚台酶的结构 F毽1-1砌腊蚺pob们馏批蛐cnE 吻合，n螺旋与B链几乎相间。手指区结构略有不同删等，200t)。 图1-2，砌膀姐聚合酶与E面f聚合酶的比坟 翔帕倦． ＆瓶m曲1d独矗粤黜鲥)由眦如d瞻唾蛐妒脚“dd，2001)。 andEoa／／Poll F培1．2跚嘲∞幽∞硝劢Ⅸ峨蹦I