丹参注射液诱导口腔黏膜下纤维性变成纤维细胞凋亡实验探究.docVIP

丹参注射液诱导口腔黏膜下纤维性变成纤维细胞凋亡实验探究摘要：目的：通过观察丹参对口腔黏膜下纤维性变成纤维细胞凋亡的影响，探讨丹参治疗口腔黏膜下纤维性变的机制。方法：将不同浓度的丹参注射液与口腔黏膜下纤雏性变成纤维细胞共同培养，显微镜下观察口腔黏膜下纤维性变成纤雏细胞凋亡，并计凋亡细胞率及活细胞率。结果：丹参诱导口腔黏膜下纤维性变成纤雏细胞发生典型的细胞凋亡形态学变化，凋亡率升高及活细胞细胞率降低呈剂量、时间依赖性，但当丹参浓度及作用时间达到一定域值后，细胞凋亡率及活细胞率变化不明显(P0.05)。结论：丹参可诱导口腔黏膜下纤雏性变成纤维细胞凋亡，且有剂量、时间依赖性。 关键词：口腔黏膜下纤维性变；成纤维细胞；丹参；凋亡 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673－717(2007)12-2565-02 口腔黏膜下纤维性变(Oral Submucous Fibrosis，OSF)是一种局限性硬皮病，以口腔黏膜硬化、张口受限为主要特征，与嚼槟榔有密切关系。其治疗目前尚无满意的方法。成纤维细胞(Fibrob]ast，FB)是合成胶原等细胞外基质的主要细胞，在OSF的发生、发展过程中起重要作用。本文通过研究丹参注射液对体外培养的OSF患者颊黏膜成纤维细胞凋亡的影响，旨在为治疗OSF开辟新途径。 1.材料和方法 1.1药物　丹参注射液(东台市康怡制药有限公司含丹参生药1.5g/mL)，浓度系参考预试验观察到的该试剂对人颊黏膜成纤维细胞增殖具有抑制作用的最低浓度而设定。 1.2人颊黏膜成纤维细胞的培养　在局麻下分别切取6例OSF中期患者颊黏膜(36.5±7.8)岁，5例健康自愿者相应部位颊黏膜[(35±8.3)岁，无槟榔、烟酒嗜好按司徒镇强等介绍的方法，采用组织块法原代培养并传代增殖。病变组和对照组均无其它结缔组织病，且半年内无服药史，实验选用第3～6代细胞。 1.3凋亡细胞的观察　分别将OSF FB、NMFB以5×10mL接种底部放置盖玻片的六孔板内，每孔2mL，培养48h后，换含不同浓度(O、30、60、90、120、150mg/mL)丹参液的新鲜无血清RPMI-1640 1mL，每浓度设3个复孔，继续孵育24h后，取出有细胞的盖玻片，显微镜下观察细胞形态，计数凋亡细胞及活细胞(200个/标本)，凋亡率及活细胞率计算公式如下：凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数，活细胞率=活细胞数/总细胞数，另设丹参(90mg/mL)作用不同时间组(0、6、12、24、36、48h)，显微镜观察及计数同前。细胞出现核浓缩或核碎片为细胞发生凋亡的判断标准。 1.4统计学处理　实验结果用百分率(p)表示，作变量变换后(x=sin-1√所有数据应用SPSS10.0软件包进行分析，检验水准P=0.05，P0.05)。 3.讨论 细胞凋亡是具有特征性形态变化的一种细胞死亡方式，在维持机体细胞数目平衡，维持机体的正常生理功能上起重要作用，是一种内环境稳定机制。近来，人们发现细胞凋亡与某些疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病，微生物感染及其他一些增生性疾病密切相关，相应地，利用细胞凋亡诱导剂或抑制剂来治疗这些疾病的研究已引起人们重视。口腔黏膜下纤维性变以黏膜下固有层胶原堆积为主要特征。国内外学者对其发病机理作了大量研究，发现其发病可能为某些诱因如槟榔、免疫、细胞因子等因素引起口腔黏膜FB增殖有关。因此，寻找细胞凋亡诱导剂抑制增殖的FB是OSF治疗研究的重要方向。 　丹参(SalviaMilfiorhizaBunse)系唇形科鼠尾草属植物的根，有活血通络之效，其化学成分主要有脂溶性的二萜醌和水溶性的酚性酸两大类，丹参注射液为丹参的水溶性部分。近年的研究证实，丹参的水溶部分具有抗纤维性变和抗氧化作用，已广泛用于抗肝、肺、皮肤、肾等纤维性变，但用于治疗OSF的研究目前尚未见报道。 　本研究结果显示丹参注射液诱导了OSF-FB凋亡，且凋亡率在一定丹参浓度和作用时间内，有剂量和时间依赖性。且随着丹参浓度增加及作用时间延长OSF-FB凋亡增加，但达到一定时间及浓度域值后，OSF-FB凋亡未见明显增加，活细胞率有上述同样变化，这些结果提示，丹参可通过诱导FB凋亡，抑制FB增殖，达到抗OSF作用，而且在一定范围内，增加丹参浓度及延长作用时间，可增加抗纤维化作用。丹参诱导OSF-FB凋亡的机制尚不清楚，推测可能与下列因素有关：①影响某些控制细胞增殖周期和凋亡的基因的表达；②影响细胞的自分泌或旁分泌细胞因子；③直接与细胞DNA交联或激活核酸内切酶，抑制DNA的复制，引起单链断裂、DNA降解，最终导致细胞停止增殖、发生凋亡。丹参对成纤维细胞影响的分子机制，有待进一步研究。 　综上所述，丹参可诱导OSF-FB的凋亡