高压氧干预对骨髓间充质干细胞培养增殖分化作用.pdfVIP

中华医学会第二十次全国高压氧医学学术会议论文汇编 ·39· 二、大会发言 9．高压氧干预对骨髓间充质干细胞培养及增殖分化的作用 南京军区福州总医院高压氧科(福州 350025) 白志峰 卢晓欣 彭慧平 王如密 采用全骨 【摘要】 目的探讨骨髓问充质干细胞(BMSCs)培养方法及高压氧干预对其增殖分化的影响。方法 髓细胞贴壁培养法提取绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞进行培养。取P3代骨髓问充质干细胞。用神经节苷脂和胶 质细胞源性神经生长因子诱导液进行成神经元样细胞诱导．并在培养及诱导时进行高压氧干预。取P3代细胞．消化至 程给氧(90分钟)．每日1次．细胞增殖期高压氧共7次．细胞诱导时高压氧共2次。未行高压氧处理的细胞做为对照 组。采用免疫荧光检测NSE表达．绘制细胞生长曲线。结果贴壁培养法分离培养骨髓问充质干细胞．经多次换液后 可达到纯化细胞。高压氧干预组间充质干细胞对数生长期提前．进入平台期后细胞数量多于对照组．高压氧干预后细胞 于24h内出现轴突、树突．48h后两组比较．高压氧干预组80％以上细胞出现突起．且突起较长、粗、连成网状．未 干预组突起的细胞比例不足80％．细胞分散、突起短、未连成网状．结论骨髓间充质干细胞全骨髓贴壁培养法操作简 单．细胞繁殖能力强．经高压氧干预后骨髓问充质干细胞生长加快．在细胞诱导时联合高压氧干预．细胞分化数量多． 突起长。提示高压氧能促进体外骨髓间充质干细胞向神经元样细胞增殖和分化。 【关键词】 高压氧l骨髓间充质干细胞；体外培养l创伤性脑损伤 rues— stem enehymal 下，可以分化为骨、软骨、脂肪及神经细胞等。由于BMSCs细胞取材方便、容易获取、免疫原性弱、 安全性好、移植方法简单，且无道德及伦理的制约，成为干细胞治疗来源的理想选择。高压氧治疗在 脑、脊髓损伤恢复中发挥着积极和巨大的作用，如果能与干细胞治疗联合起来，将会对两者的发展起到 极大的推动作用。为此，我们开展两者联合应用的基础研究。 材料和方法 1、绿色荧光蛋白(GFP)小鼠骨髓间充质干细胞培养、诱导：采用全骨髓细胞贴壁培养法分离、 瓶中，浸泡2次各10min，取出后转超净台操作，沿两股骨中间作一横切口，暴露并分离双侧股骨及 胫骨，PBS液冲洗3次，剪开股骨及胫骨双侧骨质，暴露骨髓腔，用2ml注射器吸取含10％FBS及青 链双抗液的完全培养液冲洗骨髓腔2～3次，反复吹打混匀骨髓液，制成单细胞悬液，将单细胞悬液离 心，弃上清，加入完全培养基，计数细胞并以103个／ml的密度接种在细胞培养瓶中，置于37℃，COz 培养箱。 2、骨髓间充质干细胞传代和纯化：BMSCs培养72h后更换培养液，以后每3d更换培养液，以除 去造血细胞及杂质，经多次传代后，细胞可纯化。细胞融合至80％以上进行传代：弃去旧培养液，PBS 0．5ml，待细胞伪足缩起，吸管吸尽消化液，再次加入l 冲洗2次，加入0．25％胰酶+O．02％EDTA ml消化液，轻轻摇匀、震荡，并于显微镜下观察，消化至细胞间间隙增大，细胞变圆并开始脱落，消 化至细胞脱落30％时加人等量完全培养基终止消化，用吸管轻轻吹打瓶壁，将贴壁细胞充分吹打下来， t 制成细胞悬液，离心后弃上清，加入完全培养液悬浮细胞，按1 2或1·3的比例传代。 中华医学会第二十次全国高压氧医学学术会议论文汇编 3、骨髓间充质干细胞神经诱导：取P3代细胞浓度为105个／cm2接种于置有玻片的24孔板内，细 h后换为含有神经节苷脂及胶质细胞源性神经生长因子 胞融合80％以上后加入预诱导液。预诱导24 h。