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碳链长度对双链季铵盐抑菌作用的影响 大自然的有害细菌、真菌和病毒是感染和预防人类疾病的主要原因。1915年，jykobs首次合成了季铵盐酸盐，指出这种化合物具有一定的杀菌效果。目前季铵盐广泛应用于医药、卫生、食品、饲料工业、农业、纺织、塑料、橡胶、造纸、水处理、油田开采、涂料、日常生活等多种领域。已知双链季铵盐能杀灭病毒、细菌、霉菌、真菌等各类微生物,其消毒力不受有机物污染影响,也不受光、热、硬水、酸碱度、温度、湿度等的影响,药效持续时间长;另外双链季铵盐也具有低毒、低腐蚀性和低刺激性的特点,且其杀菌效果与含氯消毒剂比较差异无统计学意义,是公认的饮水消毒、水质改良及控制禽畜疾病的良好消毒剂。双链季铵盐也可以和其它种类的表面活性剂进行复配,在消毒的同时还可以清洁物体的表面。近年来季铵盐类消毒剂有不少新的进展,主要表现在新型季铵盐的合成及杀菌性能的研究上,如经两步法合成了新型含酯基结构季铵盐杀菌剂HFAC,将其应用与造纸污水上,当用量0.01%、杀菌时间18 h时,就能达到很好的杀菌效果;溴化苄基取代吡啶类季铵盐具有较强的抗菌性能,且具有良好的物理性质,是一种新型的抗菌剂。但对同一系列双链季铵盐中碳链长度对该类消毒剂消毒能力的影响和杀菌机理的探索研究较少,以双八烷基二甲基氯化铵、双十烷基二甲基氯化铵、双十二烷基二甲基氯化铵、双十烷基二甲基溴化铵、双十二烷基二甲基溴化铵和双十八烷基二甲基溴化铵为研究对象,以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌,观察不同碳链长度季铵盐的杀菌效果。另外还对双链季铵盐的杀菌机理进行了验证。 1 材料和方法 1.1 材料和机器 1.2 方法 1.2.1 脂斜面培养物的制备 取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌24 h营养琼脂斜面培养物,用0.85%的氯化钠溶液洗下菌体并混匀。用可见光分光光度计测量3种细菌OD600的值,然后用0.85%的氯化钠溶液稀释至其吸光值为0.065时备用。 1.2.2 中和剂抑菌试验 抑菌圈试验。将100μL吸光值为0.065的菌悬液均匀涂抹于营养琼脂平板表面,抑菌片为直径5 mm滤纸片,每个抑菌片含3层滤纸,经压力蒸汽灭菌后干燥备用。在抑菌片上滴加10μL样品,阴性对照用氯化钠溶液代替样品。每个平板贴放3个抑菌片,其一作空白对照,一种药物做2种浓度。贴放后用无菌镊子轻压样片,使其紧贴于平板表面,37℃培养18 h后观察结果。准确测量抑菌圈直径,根据抑菌圈直径大小比较各消毒剂抑菌效果。试验药品取两种浓度(1 g·L-1和5g·L-1),比较这些药品的抑菌作用强弱。 中和剂鉴定试验。受试菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌,设计6组试验,按悬液定量杀菌试验程序进行。(1)消毒剂+菌悬液→培养;(2)(消毒剂+菌悬液)+中和剂→培养;(3)中和剂+菌悬液→培养;(4)(消毒剂+中和剂)+菌悬液→培养;(5)稀释液TPS+菌悬液→培养;(6)稀释液TPS+中和剂→培养。结果以(1)组无菌生长,(2)组有细菌生长但菌落数远少于(3)(4)(5)组,(3)(4)(5)组的菌落数近似相等组间误差率不超过15%,而(6)组无菌生长,则表明所选中和剂合格。 悬液定量杀菌试验。试验依据为卫生部《消毒技术规范》(2002版),实验消毒液为无菌硬水配制的原浓度样品,在无菌试管内加入试验菌悬液1.0m L。置20℃水浴恒温后,加入4.0 m L样液混匀,作用至预定时间。取0.5 m L混合液加入到装有4.5m L中和剂的试管中,混匀。中和作用10 min充分混匀取样液。37℃恒温培养24 h,进行菌落计数,计算杀菌率。以稀释液代替复配消毒液样品液接种,作为阳性对照组。 1.2.3 中和剂用量的制备 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与液体培养基中培养12~14 h,转速180 r·min-1;取浓度为5 g·L-1DDAC8的水溶液5m L(对照组为蒸馏水),加菌液5 m L,混匀。于室温中作用至预定时间,以4 000 r·min-1离心10 min,弃去上清液,加中和剂(含有1%卵磷脂和1%吐温80的溶液),再离心弃去上清液。按透射电镜生物样本制备步骤进行样品制备。 1.2.4 脂质体混悬液的制备 将卵磷脂和胆固醇以质量比为4:1混合,溶于适量氯仿中,然后将该氯仿溶液在茄形瓶中旋转震荡,直至形成均匀的悬浊液,再在一定温度的水浴中搅拌数小时即得到脂质体混悬液,4℃保存待用。取适量脂质体乳浊液于载玻片上,放在显微镜下观察。 2 对其他季铵盐的抑制杀菌能力测定 抑菌圈直径法是经常被用来检测抗菌剂抗菌活性的方法之一,试验通过该方法分别测定了上述6种季铵盐单品和一种复合消毒剂对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制杀灭能力。消毒剂的抑菌圈直径越大,表明抗菌能力越强。 2.1 双链季铵盐的杀菌机理 试验结果清楚