第二章-基因工程制药PPT.ppt

第二章 基因工程制药;第三讲 基因工程制药;第一节 概述;传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势。 应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。;利用基因工程技术生产药品的优点：;第二节 基因工程药物生产的基本过程;获得目的基因;基因工程药物生产的上游和下游;工程菌（或细胞）构建中重要的工具;;;;;;;;;;下游阶段在产业化中是极其重要;第三节 目的基因的获得; 目前克隆真核基因常用的方法有 逆转录法和化学合成法 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。;一、逆转录法 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定;cDNA克隆示意图;1、mRNA的纯化;2、cDNA第一链的合成;3、cDNA第二链的合成;4、cDNA克隆;cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。 ;cDNA文库;cDNA片段与载体的连接;方法二：加人工接头连接，用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接；cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制酶切位点。 ;5、将重???体导入宿主细胞;6、cDNA文库的鉴定;7、目的cDNA克隆的分离和鉴定;分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序以及确定基因的转录方向、转录起始点等。 1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。;二、化学合成法;第四节 基因表达;一、宿主细胞的选择;1、原核细胞-1;1、原核细胞-2;1、原核细胞-3;2、真核细胞-1;2、真核细胞-2;2、真核细胞-3;二、大肠杆菌中的基因表达;表达载体必须具备的条件;表达载体必须具备的条件;2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式;3、真核基因早大肠杆菌中的表达形式;特点：一些可被胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌蛋白质不含起始密码ATG所编码的甲硫氨酸等。但是，产量不高、信号肽不被切割或不在特定位置上切割等。;三、酵母中的基因表达;2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素;（2）外源基因的表达效率—启动子;②分泌信号的效率。分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物和前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。分泌信号是酵母菌表达蛋白的起始分泌、糖基化和蛋白折叠加工等不可缺少的因素。 ③终止序列的影响：终止序列保证产物（mRNA）在适当部位终止和加上polyA尾部，这样形成的mRNA可能比较稳定并被有效地翻译。在酵母中表达的人工合成基因一般不含终止序列，必须借用外加的终止序列或载体上现有的终止序列。常用的外加终止序列有ADH1、CYC1、MF?1和PGK。;（3）外源蛋白的糖基化;（4）宿主菌株的影响;四、动物中的基因表达;课堂作业;第五节 基因工程菌生长代谢的特点;对菌体生长地调控主要有两种观点：1.认为能量地供应决定了菌体的最大比生长率；2.认为是小分子前体和催化组分的限制决定了菌体地最大生长速率。 一、菌体的生长和能量的关系 各种碳源通过有限地呼吸能力所能提供地最大能量决定了菌 体在这种培养基中的最大比生长速率。 当菌体生长所