第二章5基因工程-重组DNA导入受体细胞PPT.ppt

第三部分 重组DNA导入受体细胞;1、转化概念 转化 ：DNA 重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化（Transformation）。 重组DNA 人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、接合以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔和显微注射等，这些导入方法在 DNA 重组技术中统称为转化操作。;感受态：受体细胞最易接受外源 DNA 片段而实现转化的一种特殊生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。;2、细菌转化的步骤： 感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等。 转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。;转化因子的吸收。双链 DNA 分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中。 整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。 转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域，形成异源杂合双链 DNA结构。;二、受体细胞;1、原核生物细胞的优点;原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性 系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也 多是无特异性空间结构的多肽链。 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统， 而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧 链的糖基化或磷酸化等修饰作用。 原核生物细胞内???性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。;3、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆 菌、蓝细菌等。 大肠杆菌受体细胞 大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得 最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也 是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载 体受体系统。 优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。 缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素 可导致人体热原反应。;枯草杆菌受体细胞 枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。 优点： 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产 物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和 加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋 白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工 程菌。 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子 遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素乙型 肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。;蓝细菌（蓝藻） 蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素 a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ(PSⅠ) 和光合系统Ⅱ(PSⅡ)、能进行光合作用，但它又 具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞 器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植 物的优点，具体表现在： 基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不 含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于 基因操作和外源DNA的检测。;细胞壁属G-，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。 营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。;4、真核生物细胞;酵母菌;动物细胞;易被重组DNA质粒转染,具有遗传稳定性和可重 复性。 经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基 中，便于提纯和加工，成本低。 缺点是:组织培养技术要求高，如培养和筛选 一个高度扩增的转化子CHO细胞，通常需要数月 之久,难度较大。;目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、 牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用 途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或 动物疫苗