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cry11aa4基因的克隆 表达及其在致倦库蚊中受体的初步研究word格式论文

独创性声明本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期:论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定,即学校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。必威体育官网网址,在年后解密可适用本授权书。□不必威体育官网网址,本论文属于不必威体育官网网址。□学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期:指导教师亲笔签名:日期:福建农林大学硕士学位论文目录摘要IAbstractII引言14 几种分离受体方法的比较64.1基于双向电泳与配体迹的分离方法64.2亲和纯化手段65ICPs对鳞翅目的作用机制7Bravo模型7Zhang模型7Jurat-Fuentes模型76ICPs对双翅目的作用机制87本研究的目的和意义9第一章BtLLP29cry11Aa4的克隆、表达与活性测定101材料与方法 101.1实验材料101.1.1供试菌株、蚊子 101.1.2质粒载体 101.1.3酶与试剂 101.1.4培养基 121.2试验方法121.2.1 Bt基因组DNA的提取121.2.2cry11A 基因的克隆引物设计 12PCR扩增产物的回收13PCR产物加A尾 克隆载体的构建 大肠杆菌感受态细胞的制备 转化和筛选 碱裂解法提取E. coli质粒克隆重组质粒的酶切分析 0 测序 171.2.3cry11A 基因的原核表达 质粒的提取 质粒双酶切 琼脂糖凝胶中酶切产物的回收 酶切回收产物连接 大肠杆菌感受态的制备 转化和筛选 表达重组质粒的酶切验证 重组融合蛋白的诱导表达与纯化 19Bradford法测定蛋白浓度20表达蛋白Cry11A的SDS检测201.2.6 生物测定 222结果与分析 232.1cry11A基因的克隆及序列分析232.1.1PCR扩增及克隆重组质粒的鉴定232.1.2 序列测定 232.1.3序列同源性分析 242.2cry11A基因的原核表达242.2.1原核表达载体的构建242.2.2原核表达载体的PCR及酶切鉴定252.2.3目的蛋白诱导表达 262.3生物测定27第二章致倦库蚊中肠与毒素特异性结合受体的研究 291材料与方法 291.1试验材料291.1.1供试蚊虫 291.1.2 试剂与耗材 291.1.3 主要缓冲液 291.2试验方法291.2.1 Cry11Aa兔源多克隆抗体血清的制备291.2.2效价测定 301.2.3Westernblot验证301.2.4 蚊子中肠刷状缘膜蛋白(BBMV)的提取301.2.5Westernblot分析Cry11与BBMV的结合301.2.6BBMV结合蛋白的分离3Cry11蛋白的生物素标记3 葡聚糖凝胶色谱分离活性片段 3Pulls down 321.2.7质谱鉴定…………………………………………………………………. 322结果与分析 32Cry11抗血清效价与Westernblot验证32Cry11与BBMV的结合33Pulls down分离的结合蛋白342.4 质谱鉴定结果…………………………………………………………………..35讨论36参考文献 38致谢 43摘要苏云金芽孢杆菌LLP29是一株具有自主知识产权的高效杀蚊菌株,为进一步了解该菌株的杀蚊毒素,本研究成功克隆分析了LLP29含有的cry11基因,结果发现该基因和已报道的cry11Aa同源性达99%以上,是一类杀虫谱较广且毒力较高的杀蚊基因。将该基因登陆NCBI,获得登陆号XQ228567,并提交Bt命名委员会,被正式命名为cry11Aa4。原核表达并纯化Cry11Aa4杀蚊蛋白,以致倦库蚊为靶标进行生物测定,其LC50 为1340ng/mL。以Cry11Aa4为抗原免疫新西兰大白兔,获得Cry11Aa4的多克隆抗体。免疫印迹试验表明,Cry11Aa4可与致倦库蚊中肠蛋白有效结合。为了分析获得的结合蛋白,构建了生物素-亲和素系统,基于生物素-亲和素的沉降试验,成功分离到了三个Cry11Aa4的结合蛋白,其分子量分别为46、52和100 KDa。经质谱分析,上述蛋白分别为ATP结合蛋白、热激蛋白和未知蛋白。其中,未知蛋白可能为一种APN。本研究为深入研究毒素与受体的相互作用、毒素的作用机制及蚊子抗性产生机理提供重要基础。关键词:苏云金芽孢杆菌;cry11Aa4;致倦库蚊;受体AbstractBacillusthu

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