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CRT高表达对二烯丙基二硫诱导人白血病HL-60 细胞分化的影响研究生：单健导师：苏琦教授中文摘要目的：研究钙网蛋白（calreticulin,CRT）高表达对二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）诱导人白血病HL-60细胞分化的影响以及与分化相关的分子机制。方法：运用RT-PCR、Western blot 实验方法观察DADS 作用HL-60 细胞后CRT 和其相关分子C/EBPα的变化情况。通过构建CRT高表达质粒，将CRT高表达质粒pcDNA3.1-12GS0643-IG-3转入HL-60细胞内，探讨CRT对DADS诱导HL-60 细胞分化的影响。通过NBT还原实验、MTT比色法、Transwell实验进一步观察CRT 高表达和DADS 作用对HL-60 细胞还原能力、增殖能力及迁移、侵袭能力的影响。结果：DADS 对人白血病HL-60 细胞CRT 表达的影响Western blot、RT-PCR实验数据表明，以浓度为1.25 mg·L-1DADS 分别作用HL-60细胞12h、24h、48h后，同未用DADS处理组相对比，随着DADS处理时间的延长，CRT 在蛋白水平和mRNA水平的表达呈逐渐下降的特点（P0.05）。2. DADS 对HL-60 细胞C/EBPα表达的影响Western blot、RT-PCR实验数据表明，以浓度为1.25 mg·L-1DADS 分别作用HL-60细胞12h、24h、48h后，同不用DADS处理组相对比，随着DADS处理时间的延长，C/EBPα 在mRNA 水平和蛋白水平的表达呈逐渐升高的特性（P0.05）。3. DADS 对HL-60 细胞迁移能力的影响迁移实验表明，用DADS分别作用人白血病HL-60细胞12、24h后，使其终浓度为1.25mg·L-1，同未用DADS处理组相比较，HL-60细胞的迁移能力随时间的延长而逐渐减弱（P0.05）。14.CRT 高表达对DADS 作用HL-60 细胞CRT 表达的影响将质粒瞬时转染HL-60细胞，置于二氧化碳细胞培养箱中培养48h后，置于荧光显微镜下观察转染效果，可见细胞发绿色荧光，表明转染成功。RT-PCR实验结果显示，CRT高表达质粒转染的HL-60细胞CRT基因水平与转染阴性质粒组相比升高，且在DADS作用后，各实验组的CRT基因水平与未处理时相比均有所下降。Westernblot显示，转染CRT高表达质粒的HL-60细胞其CRT蛋白表达水平与阴性转染组相比升高，用1.25mg·L-1DADS处理各实验组后，各组的CRT 蛋白水平与未处理时相比均有所下降。RT-PCR与Western blot表明，1.25 mg·L-1DADS 处理阴性质粒转染组、未转染组和高表达组48h 后，CRT 的mRNA和蛋白表达水平跟未处理的阴性质粒转染组、未转染组和高表达组比较均明显降低（P0.05）。表明高表达CRT mRNA 和蛋白水平均高于阴性转染组和未转染组，且DADS 能抑制CRT 表达。5.CRT 高表达对DADS 作用HL-60 细胞C/EBPα表达的影响将CRT高表达质粒和阴性质粒分别瞬时转染HL-60细胞，置于培养箱中培养48h 后，于荧光显微镜下观察，能看到转染细胞发绿色荧光，说明转染成功。RT-PCR实验显示，CRT高表达质粒转染的HL-60 细胞C/EBPα 基因水平与转染阴性质粒组相比下降，且在DADS 作用后，各实验组的C/EBPα基因水平与未处理时相比均有所升高。Western blot 显示，转染CRT 高表达质粒的HL-60 细胞其C/EBPα蛋白表达水平与阴性转染组相比下降，用1.25 mg·L-1DADS 处理各实验组后，各组的CRT 蛋白水平与未处理时相比均有所升高。RT-PCR与Western blot表明，1.25 mg·L-1DADS 处理阴性质粒转染组、未转染组和高表达组48h后，C/EBPα的mRNA和蛋白表达水平跟未处理的阴性质粒转染组、未转染组和高表达组比较均明显增高（P0.05）。表明CRT高表达组C/EBPαmiRNA 和蛋白水平均低于阴性转染组和未转染组，且DADS 能增加C/EBPα表达。6. CRT高表达对DADS 作用HL-60 细胞诱导其分化的影响NBT 实验显示，在各时间段，CRT 高表达组还原能力均弱于阴性转染组2(P0.05)，分别用1.25mgL-1DADS 和ATRA处理CRT 高表达HL-60细胞，较未处理前相比，细胞的还原能力明显增强(P0.05)，其中1.25mg L-1DADS 与ARTA 比较其效果类似(P＞0.05)。MTT实验显示，经DADS 处理后，CRT 高表达组、阴性转染组和未转染组细胞的增殖与处理前相比均受到抑制(P0.05)，表