遗传学实验课（南京大学）PCR技术及其应用.pptVIP

PCR技术及其应用 PCR技术的建立 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想—“修复复制” 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现 Mullis的构思 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 生化遗传检测的应用， 结合实验结果进行实验的原理与操作的分析， DND与RNA提取的差别， 结合实验结果进行实验的原理与操作的分析， 限制性内切酶的应用， 结合实验结果进行实验的原理与操作的分析 PCR的原理及应用 定量PCR的原理及应用 核酸电泳的原理及应用 结合实验结果进行实验的原理与操作的分析 2D电泳 第一节 PCR技术原理和工作方式 PCR技术及其应用 一、PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 Target Amplification 二、PCR反应体系 缓冲液 dNTP 引物 模版 DNA聚合酶 1. 缓冲液 标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有时使用 Mn2+ 缓冲液中还含有 50mM 的钾离子 有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。 Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率 2. dNTP 脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物 标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度） 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 3. 引物 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 引物设计原则 ①引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。 ②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 ③G/C和A/T碱基均匀分布， G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。 ④要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。 ⑤引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。 ⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 ⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 4. 模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 用人类或哺乳