遗传学实验课（南京大学）实验一肝细胞的原代分离与培养.pptVIP

考试成绩的组成 实验操作课：出勤30%，操作40%，作业30% 讨论课：出勤40% 表达60% 考试 实验一、肝细胞的原代分离及培养 实验目标 了解掌握组织中细胞分离、培养的方法 掌握台酚蓝染色进行活细胞计数方法 掌握血球计数板使用方法 器具 中号烧杯，平皿，小镊子，大镊子，小剪子，血球计数板，手套，试管架、酒精喷壶 离心管（15/50mL），吸管、100目孔径滤网、1mL 移液器及Tip头、研磨玻片 试剂 胰酶、PBS、台酚兰、75%酒精 操作步骤 1、将小鼠断颈处死，置75%酒精烧杯泡2-3分钟。 断颈法：小鼠处死最常用的方法，也是小鼠痛苦程度最小的处死方法，符合动物福利学。 操作步骤 2、用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。 注意：不要一刀剪破腹壁，这样毛容易进入腹腔，里面就不是无菌的了。镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，置于培养皿中，剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 操作步骤 3、用手术剪将肝脏剪成小块（约1mm3），再用玻片充分研磨，转移到离心管，离心1000 rpm，5min。 注意：玻片研磨既需要充分又不能用力太大 操作步骤 4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶，37℃水浴中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管轻柔吹打一次，使细胞分离。 操作步骤 5、加PBS至50 mL，用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。 注意：这个过程易损失细胞，将粘滞在筛子 上的细胞尽量用PBS冲洗干净。 操作步骤 6、将通过滤网的细胞置于15mL离心管中，1000rpm，离心5分钟，慢慢弃去上清液。 注意：将离心管从离心机取出时，动作要轻 柔，否则细胞很容易被重新悬起。 不要多次倾倒离心管，只倾倒一次。 操作步骤 7、加入红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）5mL，冲散细胞，约2min，裂解红细胞。 操作步骤 7、加入PBS 5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 操作步骤 8、加入含血清的培养液1-2 mL（视细胞量而定,在此可用PBS代替），用于计数。 操作步骤 9、细胞计数前，先用台酚蓝染料染色，细胞悬液与0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀，用血球计数板计数，计数活细胞。 台酚蓝（Trypan Blue) ：是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。还常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。 血球计数板使用方法 视待测细胞悬液浓度，加适当PBS稀释细胞，以每小格的细胞数可数为度。 取洁净的血球计数板一块，在计数区盖上盖玻片 将细胞悬液摇匀，用20ul加样枪吸取少许，从计数板盖玻片边缘滴入一滴细胞悬液，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，勿使气泡产生。边缘多余的悬液用吸水纸轻轻拭去。 血球计数板使用方法 静置片刻，待细胞沉降到计数板，不再随液体漂流 如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 血球计数板使用方法 计数重复3次，取其平均值 使用完毕，用自来水清洗血球计数板，勿用硬物洗刷 计数板计算公式 细胞数/ml=(4个大方格内的细胞数/4)×104×稀释倍数 细胞存活率计算 细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100% 思考题 1、什么是细胞的原代培养与传代培养？ 2、除了台酚蓝染液，还有哪些染液可用于细胞死活的鉴定？ 3、简述采用灌流方法分离肝细胞的技术有哪些？ 4、血球计数板的使用方法及注意事项？并计算本实验中的细胞数量。 实验安排 小鼠抓持方法　 注意：小鼠很灵活，头部固定不牢，易被其反咬！！ 镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏， 血球计数板构造 每个大方格 面积：1.0 毫米 × 1.0 毫米=1.0 平方毫米 容积：1.0 平方毫米 × 0.1 毫米= 0.1 立方毫米。