猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析.pdfVIP

猪病防治篇 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因 的变异分析 汤德元扣，赵启祖扣，李春燕1，刘霞1，邹兴启2，范运峰2，朱永兴1 (1贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；中国兽医药品监察所，北京10081) 摘要：为了调查猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异，本研究收集了16家规模化养殖场 析表明流行毒株属于美洲型，ORF5基因发生离散性变异可以分为三个簇，与我国其他地区分离高致 病性PRRS病毒关系密切，而与早期分离的PRRS毒株关系疏远，说明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5 基因存在变异现象。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征；ORF5基因；变异分析 and 猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiverespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与 呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的一种新的传染病。 该病在临床上主要表现为感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎， 断奶仔猪肺炎、育肥猪生长迟缓，传染性强，常继发细菌和其它病毒感染，是目前造成我国养猪业 严重经济损失的重要疾病之一。 PRRSV为一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒大小约15个kb，含有8个开放阅读框 此，对ORF5基因变异的分析在一定程度上可以反映整个病毒基因组序列变异的情况，因而ORF5基 因可作为分子流行病学调查的对象。本研究参考PRRSV的LV、VR一2332毒株的核酸序列， 设计1对特异性引物，对采集的病料进行RT—PCR扩增，以检测猪蓝耳病病毒是否存在，并对30 个PRRSV毒株ORF5基因序列的测定结果进行了核苷酸序列、氨基酸序列和遗传进化树比较分析，借 定的参考依据。 1材料 1．1病料的采集及处理 病料样品来自多个地方养猪场和养猪户乜1。检测样品无菌采集于16家规模化养殖场48份疑似 作者简介：汤德元(1964-)，男，教授，博士，硕士生导师，研究方向为动物病毒分子生物学及中西兽医结合 E—mai l：tdyuan@163．com 宰通讯作者2：赵启祖，E-mail：zhaoqizu@ivdc．gov．an 415 中国畜牧兽医学会养猪学分会2009年学术年会 “回盛生物”杯全国养猪技术论文大赛论文集 PRRS猪(含流产死胎)的心、肝、脾、肺、淋巴结和肾的病变组织、血液、血清，其每一病例各病 乳剂，用液氮反复冻融3次后，12 用。血清学样品来自16个规模猪场共105份样品，无菌采血，分离血清，置-20。C冰箱保存待检， 1．2试剂 TRIzol DNA聚合 LS@Reagent购自Invitrogen公司：hMV反转录酶、RNaseInhibitor、Taq DNA 酶、dNTPs、DTT、DL2000Marker等均购自大连宝生物工程有限公司。 1．3引物 ATCCVR-2332、PRRSV 根据GenBank中收录的PRRSV LV和中国标准株CH-Ia的基因序列，应用 生物软件DNAstar，设计1对针对ORF5全基因的引物，扩增产物预期大小为748 bp。引物序列如下： PrimerF 5’-GAGACCATGAGGTGGGCAAC-3 PrimerR 57一GCATATATCATCACTGGCGTG-3’ 1．4病毒总RNA的提取 Ls@Reagent试剂盒操作说明书提取病毒总RNA．在生物安全柜中37。C干燥15～20min，加入2儿 DTT、7此DEPC处理水、1儿RNase 时进行RT-PCR，也可于-80。C保存待检，但保存时间不能太长。 1．5 RT-PGR检测 RNA、5x