猪肺炎支原体可疑样品PCR检测方法的建立.pdfVIP

第十三次学术研讨会会议论文集 749 314 749 314 506 314 3讨论 本实验用7条随机引物对3株猪肺炎支原体和2株猪鼻支原体基因组DNA进行RAPD研究， 得到一系列的重复性较好的DNA指纹图谱，5株菌株扩增条带和位置均不同，说明了5株菌株基因 组DNA多态性。基因组DNA多态性反映了3株猪肺炎支原体和2株猪鼻支原体基因组DNA序列 中碱基数和拷贝的差异，代表了不同菌株具有特定的自身性质。猪肺炎支原体种特意性片段为38lbp， 猪鼻支原体种特意性片段为1914bp和2285bp，且实验具有很好的可重复性。这为猪肺炎支原体和 猪鼻支原体的啪鉴定提供了参考。 ◆考文献(略) 猪肺炎支原体可疑样品PCR检测方法的建立2 刘茂军邵国青冯志新王海燕甘源 刘冬霞 江苏省农业科学院兽医研究所．农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室．国家兽用生物制品工程技术研究中心·江 苏省生物兽药筛选服务中心，江苏南京210014) 摘要本试验建立病猪肺脏组织和可疑培养物的处理方法，根据猪肺炎支原体的P36基因设计一对引物，建立猪 肺炎支原体PCR检测方法，并对该方法进行了特异性和敏感性试验。使用建立的方法检测了临床样品。结果成功建 立了病猪肺脏组织和可疑培养物的猪肺炎支原体PcR检测方法． 关冀词猪肺炎支原体；病料；PCR；检测 ofswine，MPs)，又称猪气喘病，猪地方流行性肺炎 猪支原体肺炎(Mycopl硒maIpneumonia 院基金(6110734)。 通讯作者：邵国青，(Tel)025(B呦iI163．com 猪的传染病一其他 (EPP)，是一种经呼吸道感染的慢性病。我国将该病列入二类动物疫病，该病在全世界广泛存在， 严重危害养猪、Ik健康发展。我国是世界养猪大国，每年在MPS上损失百亿元以上。Mhp感染猪后， 引起猪呼吸道上皮纤毛细胞的脱落，成为诱导疾病，特别是其它免疫缺陷性疾病发生的重要因子， 从而使得疫曲．的免疫效力减弱或引起免疫失败，给养猪、Jk带来了巨大的损失¨1。因此，建立该病病 原的快速榆测方法将有助于本病的研究和控制。猪肺炎支原体(^砂c印肠s打搬砂印nP“，，1．D，l砌已，Mhp) 是引起MPS的主要病原之一。目前，检测Mhp的常用方法有分离培养、微粒凝集试验、荧光抗体 法、核酸探针法和PCR法。Mhp培养条件要求苛刻，易于被其它支原体所掩盖，血清学检测方法与 其它支原体之间存在严莆的交叉反应，从而给Mh的鉴别诊断带来了困难¨J。pCR法较其它方法敏 感、快速，适宜于大批样品的检测以及流行病学的调查。猪肺炎支原体P36蛋白是其种特异性细胞 溶质蛋白，具有L一乳酸脱氧酶(LDH)活性。因此，本项目选用P36基因为PCR的扩增目标，建 立了Mhp可疑病料和培养物的检测方法。 l材料与方法 l材料与方法 1．1材料 猪肺炎支原体J株、猪鼻支原体(^砂c叩肠J搬缈D砌拥括，Mh)、絮状支原体0坳c印缸跏姐加cc“肠馏， Mf)和鸡毒支原体(坳c印缸sm口gn≠f括印fjcHm，Mg)为江苏省农业科学院兽医研究所保存。 猪肺炎支原体阴性猪肺为初牛的乳猪的肺脏，经培养检测，无支原体。猪肺炎支原体阳性对照 猪肺为分点注射入猪肺炎支原体J株培养物的猪肺炎支原体阴性猪肺。 1．2方法 1．2．1病料样品处理 按照参考文献的采样方法采样，采集待检猪的肺脏置于一20℃保存【4l。将TE缓冲液按1：10加 入组织中，研磨成悬液，装入火菌的1．5mL E仟endorf管中，于．20℃反复冻融三次，在高速冷冻离心 机上，以3000r／min，离心10 111in，取上清250uL。阴阳性肺脏对照也同样处理。 1．2．2可疑培养物样品处理 取可疑培养物25ml 洗