猪链球菌2型溶血素重组亚单位疫苗的研制.pdfVIP

·58· 第三届南京农业大学畜牧兽医学术年会论文集 猪链球菌2型溶血素重组亚单位疫苗的研制 吉利伟，蔡伟刚，刘民星，杨秋实，孔建涛，范红结’ (南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京210095) suis 摘要：根据已报道的猪链球菌2型(Streptococcustype 白亚单位疫苗保护率高。 关键词：猪链球菌2型；溶血素；克隆；原核表达；免疫效果 猪链球菌病是世界各国常见的一种猪传染病，以 提取试剂盒由天为公司提供；其他试剂均由南京生兴 急性败血型、脑膜炎型和关节炎等为主要特征，危害 严重【l五J。1998年夏江苏某地暴发猪败血性疾病，经种W／O／W型的新型佐剂。使用前将该佐剂和抗原在 suis 分离鉴定确定病原为猪链球菌2型(Streptococcus30℃左右预热，然后将佐剂和抗原按1：I的质量比 或5．4：4．6的体积比混合乳化。铝胶由农业部南京 type2)f3]；2005年7月，四川部分地区又暴发SS2 引起的人、猪重大疫情HJ。由于该菌来势猛、传播 药械厂惠赠，以10％的比例与疫苗混匀使用。 快、病程短、病死率高，呈世界暴发流行趋势，不仅 1．3溶血素基因的获取 给养猪业造成了重大的经济损失，也极大地危害着人 1．3．1 目的基因的提取 类生命安全和公共卫生，成为继禽流感之后的又～重 细菌培养扩增后用CTAB法提取细菌基因 要人畜共患病病原体¨曲一。 组DNA。 目前，对猪链球菌病的防治主要采用抗生素治疗 1．3．2引物的设计与合成 结合全菌灭活苗免疫预防，抗生素治疗存在耐药性和 根据GenBank中已经发表的猪链球菌2型溶血素 Premier5．0 药物残留等不足，而灭活疫苗免疫效力有待提高，一 基因的序列(DQ443533．1)，利用Primer 般需要免疫2次才能提供有效的免疫保护，研制预防 软件设计引物1对引物。 猪链球菌病的新型疫苗是当务之急。亚单位疫苗是新 3’ 型疫苗的发展方向之一。溶血素(Hly)是猪链球菌 3’ 2型重要的毒力因子【_¨，纯化的SS2溶血素制备的亚1．3．3 目的基因的PCR扩增 单位疫苗免疫小鼠可以完全抵抗2型强毒菌株的攻 以上述提取的细菌基因组DNA为摸板，PCR扩 击，说明溶血素是一种重要的保护性抗原哺1。本文 增目的基因，采用25止反应体系，循环反应参数 为：94℃5rain；94℃变性50S，52oC退火35s， 采表达了SS2溶血素，并评价其免疫原性，为SS2溶 血素重组亚单位疫苗的开发提供基础材料。 72℃延伸1．5min，共30个循环；最后72延伸 10 min，保存于4oC。1％琼脂糖凝胶电泳回收产物。 1材料与方法 1．4重组质粒的构建 1．1菌株、质粒和试验动物 对质粒pET-32a进行扩增、提取及酶切，对目的 基因PCR产物酶切。将酶切产物连接并转化至感受 猪链球菌2型菌株ZY05719系南京农业大学动 物医学院兽医微生物与免疫学教研组2005年从四川态细胞。在含有氨苄的LB平板上随机挑取6