胰腺癌中miRNA基因序列变异的研究.docVIP

精品论文 参考文献 胰腺癌中miRNA基因序列变异的研究 朱政 （苏州大学附属第一医院腔镜病区 江苏 苏州215000 ） 【摘要】MicroRNAs（miRNA）是一类约20~22碱基大小的小分子非编码RNA。是一类新发现的在转录后水平负性调控基因表达的基因调控因子。miRNA在多种肿瘤中都存在表达异常。miRNA表达异常可能在胰腺癌的发生中起到了重要作用。本课题假设miRNA的基因序列在胰腺癌中存在变异，因此检测了8种miRNA在胰腺癌组织及肿瘤细胞株中前体的基因序列。总共发现了4种新的基因序列的变异。miRNA定量分析显示，miR-21在20例胰腺癌病例标本及6种肿瘤细胞株中均有显著的高表达。新发现的一个位于pre-miR-21基因下游29个碱基处的A-G突变导致了其附近二级结构的改变，并引起miR-21的相对低表达。这些结果显示miRNA可能在胰腺癌的发生中起到了重要的作用，但是其基因序列的变异引起表达异常的分子机制仍待进一步的研究。 【关键词】microRNA，胰腺癌，启动子，二级结构【中图分类号】R735.9【文献标识码】B【文章编号】1007-8231（2011）12-2265-03 前言 胰腺癌因为早期就会发生转移，病人就诊时往往已是晚期，并且对放化疗不敏感，是一种非常致命的疾病，预后很差［1,2］。经过数十年的研究，人们对胰腺癌发生的分子机制仍然所知甚少。因此，进一步研究与肿瘤的发生、发展有关的基因有助于我们诊断及治疗这种疾病。 一类新发现的小分子非编码RNA—microRNA（miRNA），可能会给肿瘤的研究带来新的认识。miRNA是一类20-22个碱基大小的小分子非编码RNA，在转录后水平负性调控基因的表达。它们结合到目标mRNA的3rsquo;非编码区后，通过分解mRNA或抑制其翻译来负性调控目标基因的表达。miRNA首先从基因组DNA转录为一个大分子转录子pri-miRNA，然后在细胞核内由Drosha酶加工成发卡结构的pre-miRNA。Pre-miRNA接着被Exportin-5转运至细胞浆内，由Dicer酶加工为成熟miRNA［3-5］。 目前的研究显示，miRNA可以起到类似肿瘤抑制基因或癌基因的作用［3］。miRNA在肿瘤中所起的作用，主要与其异常的表达水平有关。在胰腺癌及多种肿瘤中，miRNA的表达图谱已陆续有人报导［6-13］。 调控miRNA表达及成熟的确切机制尚不明确，但之前的研究提示了几种可能的机制，包括遗传学和表观遗传学的变异［14,15］。miRNA的基因突变，可能会对其转录、加工或是识别靶基因的过程产生影响［16］。本课题的目的是发现胰腺癌中miRNA的基因突变，并研究其功能。 1材料及方法 1.1材料 共收集了20例在2009年到2011年间在苏州大学附属第一医院接受手术治疗的胰腺导管腺癌患者的病例标本。包括肿瘤组织及周围正常胰腺组织。这些标本都是新鲜冻存，并经过病理学确诊的。同时收集了5例正常胰腺组织标本及7例健康人外周学基因组DNA标本。培养了6例肿瘤细胞株：BXPC-3、CFPAC-1、 PANC-1及SW1990（胰腺癌细胞株）；MDA-MB-231（乳腺癌细胞株）；HEP G2（肝癌细胞株）。使用AxyPrepTM Multisource Genomic DNA miniprep试剂盒提取DNA，Trizol提取RNA。 1.2检测miRNA的基因突变 首先参考了cDNA基因芯片数据［11-13］、aCGH数据［17-21］以及其他肿瘤的相关文献［6-10］，挑选出如下8种可能于胰腺癌有关的miRNA：miR-15a、 miR-16-1、miR-21、miR-155、miR-196a-1、miR-196a-2、miR-219和miR-375。使用PCR扩增了每个pre-miRNA大约800 bp长度的基因组片段（包括上游约500 bp及下游约200 bp）。此长度的基因组片段基本包括了miRNA基因的所有功能区域［22］。PCR引物序列及反应条件见表1。所有标本均送上海英骏生物技术有限公司测序。 1.3TaqMan实时定量RT-PCR 采用实时定量RT-PCR检测miR-21的表达水平。首先使用TaqMan 2ⅹ Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG试剂盒合成cDNA。再用TaqMan miRNA assays试剂盒检测成熟miRNA表达水平。使用RNU6B作为内参。所有的PCR反应都在Rotor-Gene 3000 real-ti