Survivin靶向siRNA重组表达载体的构建与鉴定.docVIP

精品论文 参考文献 Survivin靶向siRNA重组表达载体的构建与鉴定 杨红 刘月波 黄桂云 张铀（通讯作者）（云南昆明医科大学第二附属医院血液科 云南昆明 650101） 【摘要】 目的 构建Survivin靶向siRNA重组表达载体。方法 根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，选择设计一对带发夹结构的核苷酸序列，克隆到空载体pSIREN-DNR-DsRed-Express中，转化DH5а菌株，提取质粒进行酶切鉴定和测序分析以及菌落PCR。结果 经质粒PCR、菌落PC及测序证实Survivin靶向siRNA重组表达载体结果与设计完全一致。结论 Survivin靶向siRNA重组表达载体构建成功。 【关键词】RNA干扰 surviving 基因治疗 Survivn是凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的新成员，独立于B型淋巴瘤细胞因子2（Bcl-2）家族，是迄今为止发现的作用最强的凋亡抑制因子。survivin蛋白调节所有细胞分裂和存活，并且广泛表达于人类大多数恶性肿瘤组织中[1],因此特异性针对survivin的基因治疗具有良好的靶向性、特异性和安全性。本实验用基因克隆技术构建Survivin 靶向的小干扰RNA即siRNA重组表达载体，探讨用RNA干扰方法干扰肿瘤细胞中的Survivin基因的表达，从而为肿瘤的基因治疗提供理论依据。 1 材料与方法 1.1大肠杆菌DH5а，质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express购自大连宝生物公司，T4DNA连接酶，BamHⅠ限制酶EcoRⅠ限制酶，DNA Marker均购自大连宝生物公司。 1.2靶向Survivin基因siRNA的设计 Survivin基因序列来自GeneBank(编号NM001168)，利用GenechemTMsiRNA设计工具，参照siRNA设计原则，在Survivin的序列中选取理论上最佳的一段作为靶序列为：5，-GGACCACCGCATCTCTACA-3，（78-96），针对这段靶序列设计相应的DNA序列，经Blast分析证明与人类其他编码序列无同源性。在设计的寡核苷酸链中，两端分别为BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，能够与线性化的载体直接连接。人工合成2对互补并编码相应短发夹siRNA的寡核苷酸链。ShRNA-Survivin1（阳性） 5-GATCCGGAACCACCGCATCTCTACATCGTGCTCCTGGTTGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTG-3，（正义链）， 5-AATTCAAAAAAGGAACCACCGCATCTCTACACAACCAGGAGCACTATGTAGAGATGCGGTGGTCCG-3，（反义链）； ShRNA-Survivin2(阴性): 5-GATCCCCCAACGATCTGCACACGTTAGTGCTVVTGGTTGACGTGTGCAGATCGTTGGGTTTTTTG-3，（正义链）， 5-AATTCAAAAAACCCAACGATCTGCACACGTCAACCAGGAGCACTAACGTGTGCAGATCGTTGGGG-3，（反义链）； 下划线为连接酶位点。 1.3线性化载体的制备 将质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物并回收大片段。 1.4单链目的基因survivn片段的退火连接 各用50mu;l退火缓冲液溶解上述合成2 OD的单链目的基因片度，稀释成0.01OD/mu;l。各取1mu;l（即1mu;l正义链+1mu;l反义链）+1mu;l退火缓冲液混匀。94℃水浴退火，自然冷却至室温，30℃水浴90min，4℃保存。 1.5重组表达载体的连接与转化 将稀释的Survivn退火片段与线性化的pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒表达载体连接。连接反应条件为：稀释的Survivin退火片段1mu;l，显性化的pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒载体1mu;l，10X连接酶缓冲液1mu;l，T4DNA连接酶1mu;l，H2O 6mu;l，22℃水浴反应过夜。重组表达载体分别命名为Survivin-1，Survivn-2。 各取5mu;l过夜连接产物转化感受态细胞DH5а。 1.6阳性克隆筛选和鉴定 设计测序引物序列，由大连宝生物合成。pSIREN-P1: 5，-TGGGCTATGAACTAATG