PCR在临床中医学检验中应用.docVIP

精品论文 参考文献 PCR在临床中医学检验中应用 陈楠（山东省威海市中国人民解放军四零四医院 264200） 【中图分类号】R456 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）05-0039-02 聚合酶链反应 (简称 PCR)是一种在体外扩增特异性DNA序列的技术1985年由 M ullis发明,S alki等首先应用于临床，由于它在很短时问内可使靶序列扩增2times;105～106倍，具有快速、简便、灵敏、及时、对样品要求不高等优点，所以其应用范围迅猛扩大，衍生出了多种新的PCR技术，如原位PCR技术、实时定量PCR技术、NASBA、TAS等，广泛应用于临床的检验和科研工作中，并极大地完善了检验技术，在临床诊断和治疗中的意义重大，在病原体鉴定、产前诊断等方面都作出了相应的贡献。 1 PCR技术的概述 PCR是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，是分子生物学中最常用的技术。典型的PCR由①高温变形、②低温退火??③适温延伸三个步骤，作为一个循环周期，多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增，具有敏感性高、特异性强、操作简便、快速省时等特点。其灵敏度可达到 Pg 级，甚至达到 Fg 级水平，而被扩增的基因片段能与原基因片段保持不变,技术操作简便、快速而易掌握，并且对标本要求不高。用过去的方法完成一项试验少则几周，多则几个月。应用全自动扩增仪，整个过程均由电脑控制，只需数小时即可完成整个试验过程，用极微量的粗制标本就可获取目的产物.检验医学中的分子生物学技术有两种发展趋势：一是定量PCR，二是PCR的全自动化，如一次性试验卡（将应用扩增与检测融于一体），可很好地解决PCR的污染问题。 科学研究已证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关。基因诊断被公认为 实验诊断的发展方向。有专家认为，实验诊断经历了生化诊断、免疫诊断的发展阶段，正进入基因诊断的新时代。生化和免疫诊断是根据表型诊断疾病，基因诊断则是从本质上认识疾病。1995年，美国国家临床检验标准化委员会(NCCLS) 发表了关于感染性疾病分子诊断应用准则的文件。该文详细论述 了分子诊断应 用范围、条件和质量控制细则［1］。NCCLS分子微生物委员会主席Enns断言，以基因探针和基因扩增为主的分子生物学方法将取代传统的病原体培养和生化检测方法。1998 年，国际临床化学学会发布了关于分子扩增(主要指PCR) 在临床诊断中应用的质量评估基础的文件。该文件肯定了PCR作为临床 常规检验技术的良好发展前景，对PCR操作的各个环节进行了详细论述［2］上述两个权 威性文件都特别声明，以PCR技术为主的基因扩增技术本身在不断发展变化，目前只能是确立某些原则，尚难统一规定实验室质量控制标准。 PCR的应用 在病原体鉴定方面的应用 1.1目前，嗜肺军团菌检测方法主要有分离培养、血清学试验、生化表型鉴定、脂肪酸成分分析、分子生物学检测等。 分离培养法作为检测嗜肺军团菌的金标准，其特异性可达100%，但生长缓慢、耗时长、需要营养条件苛刻，不适于快速检测; 血清学试验简便快速，但容易产生交叉反应现象［3］;生化表型鉴定对试剂和仪器要求简单，但只能初步鉴定一些特殊的种属［4］;肪酸成分分析相对恒定，却受细菌生长条件的影响［5］;分子生物学方法如随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、串联重复序列(MLVA)等，虽快速、敏感，但极易污染，缺乏统一的标准［6］。 1.2结核杆菌复合群IS6110 基因序列、人型结核杆菌基因序列，分别设计合成特异性引物与探针，利用实时荧光PCR对结核分枝杆菌病原菌进行检测，建立了结核病原菌的快速检测方法。该方法具有较高的灵敏性及特异性，与常用实验室检查方法痰涂片、组织活检病理的阳性率及方法差异性进行评估，明显优于传统方法，且该方法对于支气管肺泡灌洗液的检测优于痰，可以用于结核分枝杆菌检测。 1.3建立基于O抗原修饰基因的福氏志贺菌血清型PCR分型方法。针对O抗原合成基因wzx和O抗原的修饰基因gtrI，gtrIc，gtrII，oac，gtrIV，gtrV和gtrX设计引物，以常见的14种福氏志贺菌血清型（包括1a、1b、1c、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、Y、X、Xv和F6）为标准菌株，建立福氏志贺菌血清型多重PCR。 1.4特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化 此外应用PCR 方法从基因水平对细菌进行检测，必须正确选择所要扩增的目的基因。现提出以下方面的建议:（1）对所有检测细菌的相关基因及序