NGAL表达在正常与原位胰腺癌裸鼠的对比研究.docVIP

精品论文 参考文献 NGAL表达在正常与原位胰腺癌裸鼠的对比研究 王永成1 刘焱森2 邓汉东2 (1广东惠州市惠州市河南岸医院 516027; 2广东惠州市第三人民医院 516000) 【摘要】目的 探讨在裸鼠动物模型中胰腺癌NGAL表达情况。方法 人Mia PaCa-2 和Capan-2胰腺癌细胞株培养，裸鼠皮下胰腺癌细胞注射成瘤后，将瘤块取出切碎后裸鼠胰腺原位移植建立裸鼠原位胰腺癌动物模型，于术后处死裸鼠，采用大体标本观察和病理切片HE染色的方法观察模型中肿瘤大小、转移情况和胰腺癌神经侵袭的情况。结果 NGAL 的阳性表达率在胰腺癌和正常组织中比较，差异有统计学意义(P＜0.05); NGAL 表达与胰腺癌分化程度、病理类型、临床病理分型、淋巴结转移密切相关。结论 NGAL可能在检测胰腺癌发生、进展、转移中具有一定作用。 【关键词】胰腺癌 鼠 皮下种癌 原位植癌 原位诱癌 模型 动物 【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）17-0087-02 胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤，好发于中老年男性，多数患者发现时已发生转移，预后差。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin,NGAL)是Lipocalin家族的成员之一,可能参与免疫炎症反应以及肿瘤的发生发展特别是肿瘤的浸润转移等过程[1]。为便于更深入地研究胰腺癌侵袭的发生、发展规律，建立有效的胰腺癌动物模型就显得越来越重要，现报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 人胰腺癌细胞株 Mia PaCa-2（M.D.Andson癌症中心馈赠）； Capan-2 （中南医学院附属医院馈赠）；DMEM培养液（天津圣东生物科技公司）；胎牛血清 （天津圣东生物科技公司）；胰蛋白酶（TRYPSIN生物制品公司）。 1.1.2 实验动物 BALB/c-nu/nu雄性裸鼠20只购于北京维通利华实验动物技术有限公司，鼠龄4周。在无菌室内层流架中饲养，恒温恒湿，垫料、饮水及饲料均经灭菌处理。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 将Mia PaCa-2和Capan-2胰腺癌细胞株从液氮中取出，加入含10%胎牛血清和青霉素 5万U，链霉素50 mg DMEM培养液 20mL，待培养液中细胞贴壁生长且基本铺满瓶底，细胞状态良好时，加入0.25%胰酶消化液1～2 mL，显微镜下观察发现细胞胞质回缩、细胞间隙增宽时，加入含10%胎牛血清DMEM培养液终止消化。将细胞悬液加入含10%胎牛血清DMEM培养液重悬细胞，细胞培养期间定期于倒置显微镜下观察细胞形态。 1.2.2 建立裸鼠原位胰腺癌模型[2] 1）裸鼠皮下成瘤：将培养瓶中的细胞用胰蛋白酶消化形成重悬细胞成单细胞悬液备用。裸鼠分两组（正常对照组10只，胰腺癌组10只），对照组每天腹腔注射生理盐水0.2m1；胰腺癌组：接种人胰腺癌细胞株注射到已消毒的裸鼠双侧腹股沟皮下，待其成瘤。 2）裸鼠胰腺原位种植：待皮下瘤块长至直径约1cm，处死裸鼠，取出皮下瘤块，无菌条件下剪切为约1 mm3大小瘤块备用。将备用瘤块塞入包膜下。 3）于术后处死裸鼠，将所有裸鼠腹腔内肿瘤及临近脏器，肝脏、网膜、腹膜后组织一并取下，取肿瘤长宽高，按体积V=4/3times;pi;times;r1times;r2times;r3计算肿瘤体积，留取部分瘤块-80℃冻存备用，其余组织10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，光镜下观察其发生转移情况。 1.2.3 免疫组化测定 用已知阳性结肠癌组织切片作阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照。 染色结果判定:NGAL免疫阳性细胞为细胞浆和(或)细胞膜内表达棕黄色或棕褐色染色颗粒的细胞,在低倍镜(10times;10)视野下选择阳性细胞密度最大的区域,然后在高倍镜(10times;40)下选取5个视野,每个视野计数100个肿瘤细胞,计数500个肿瘤细胞中染色阳性细胞数。 1.3 结果判定 采用IP(intensity+percentages) 评分方法[3]，综合考虑染色强度和阳性细胞数，由两位病理学专家独立阅片，再讨论确定免疫组织化学结果。①染色强度计分，细胞浆无染色:0分;淡黄色:1分;棕