糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶5和蛋白激酶A参与调节Tau蛋白磷酸化.pdfVIP

曲忠森等：糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶-5和蛋白激酶A参与调节Tau蛋白磷酸化·1309· 200r7；34(12) 1．3实验方法 仪计数．酶活性用各样本与对照相比较所得相对活 1．3．1动物分组及处理．SD雄性大鼠20只，随机性表示． 分为对照组，Con+mscovitiIle组，DM组，DM+1．3．4 cdl【．5活性测定．将分离出的海马在0～4℃ 000r／min roscovitine组．除对照组和Con+mscovitme组外，用10％匀浆提取液匀浆，匀浆液在4℃10 所有大鼠禁食12h，以0．1mol／L柠檬酸缓冲液离心lOmiIl，取上清液，并转移到另一EP管中， 加入2 0H4．4)在冰浴中配成20g／L的STZ溶液，按 55 h测血糖大于16．7mmol／L者Santa miIl， m非g腹腔注射，72 Cn亿Biotechn0109yhlc)，4℃静置30 12 为DM模型鼠．DM+roscovitine组：于实验的第29000r／min离心10s，将上清液转移到另一EP 天，用立体定位仪取平颅头位固定大鼠，确定 管中并加入l斗gCdl【．5多克隆抗体，4℃静置1h， 12 双侧前囟后3．8mm，中线旁2．5衄，颅骨表面下 000r／min离心后收集免疫复合物，加入20¨g 3．0衄为海马背部，用匀速推进器向海马注射 SDS—PAGE加样缓冲液，100℃加热3min离心去除 50衄。儿的rosco、ritine 1一(Sigma公司，粉剂溶于 Histone CnIz， DMso)【51，1．5min内完成．con+roscov{tine组：取2．5¨g Hl作为Cdl【-5底物(Santa miIl，闪烁仪计数，酶 同月龄的健康雄性sD大鼠，经立体定位仪确定海 Biotecllnolo盯hlc)，孵育30 mm01／L的活性用各样本与对照相比较所得相对活性表示嗍． 马背部，用匀速推进器向海马注射50 rosco们tine l¨l翻，1．5min内完成．以上手术大鼠 于术后2～4h苏醒，可以自行活动，自主进食及饮 出的海马，O～4℃用10％匀浆提取液匀浆．匀浆液 000 mill，取上清，沸水中变 水，于手术后第2天(第30天)实验结束时断头取脑，在4℃10 r／min离心10 迅速分离出海马备用，其余大鼠也于第30天实验结 性10min，冷却后备用．用10％聚丙烯酰胺分离 束时断头取脑，迅速分离出海马备用． 胶，将蛋白质提取物分离，再将其转印到硝酸纤维 1．3．2钙离子浓度测定．用冰冷的Hank，s液将分膜上，用5％脱脂牛奶室温下封闭1h，再用5％脱脂 离的海马洗涤3次，剪碎后加入O．125％胰蛋白酶，牛奶稀释的特异性抗体Tau—l(1：30ooO稀释)， mill，l500 37℃消化20 r／min离心5min，沉淀经台 mol／IJBS 氏液(含140mmoⅥ。NaCl，3 mmoⅥ。KCl，育2h，经O．05 7．5)漂洗，用5％脱脂 0H