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分子生物学方法 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应) 荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增） PCR原理:实质就是体外基因复制技术 Mg2+ dCTP dGTP dUTP dATP Taq DNA聚合酶 AmpErase Primer 靶序列 加热变性95 °C 靶序列引物退火55 °C 引物延伸72 °C 原理图示 一 二 三 完成一个循环 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 荧光定量PCR Taqman 技术 特异性荧光双标记探针 Taq酶 5’→3’外切酶活性 染料法的优点：成本低不需要探针；适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精确定量部分关键样品；融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体； 染料法的缺点：无模板特异性 不能分辨主带与杂带，给出的是总信号；不能做多重检测 每孔只能检测一个目标基因；灵敏度低适合于5000 拷贝以上的基因定量。 与DNA结合时发光 游离时不发光 SYBR Green I染料法 举例：基于结核分枝杆菌插入序列IS1081，建立SYBR Green荧光定量PCR方法。实验结果： 图2.3：标准曲线 引物二聚体 1copy 图2.4 融解曲线 10copies/uL 1copy/ul 阴性对照 105copies/ullL 107copies/uL 106copies/uL 图2.5:重复性及灵敏度检测 1 3 4 2 图2.6 特异性检测 1）牛型分枝杆菌；2）结核分枝杆菌；3）BCG；4）阴性对照 市场上常见的实时荧光PCR仪 罗氏Lightcycler MJ opticon2 伯乐icycler ABI7000 杭州博日（原大和）linegene * 实验室常用检测技术简要介绍 主要内容 概述 疾病鉴别诊断过程 临床症状和大体病变检 病料的采集及处理 实验室检验 病料中细菌的检测 病料中病毒的检测 一 、疾病鉴别诊断过程 临床标本的采集及处理 原则 合理的采样时机 正确的采样方法 适宜的采样部位 一 、标本采集 尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标本应做适当的标记，如动物、地点、时间、暂定的诊断等。 1 唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定病毒。 2 鼻、咽及肛门拭子 3 粪便标本 4 脑脊髓液、心包液、尿液等 5 尸体材料 死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。 不同病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取肺、PRRS取肺、SFV取淋巴结等。 二 标本的保存和运送 尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实验室；如有延误，则标本必须冷藏，到实验室立即处理和接种，延误时间短的，可置4℃；时间延误较长，置-70℃。 如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。 三 标本处理 1 体液 可以直接接种、检测 2血标本 凝固血离心后的血清即可用于检测 3各种拭子 4粪便标本 5 组织材料 病原学检测常用的实验室技术 分离培养 （“金标准”） 形态学检查 （病毒 电镜镜检） 细菌的生化试验 动物实验 免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化 分子生物学诊断技术 PCR 荧光定量PCR 二、病料中细菌的检测方法 细菌的形态学检查 细菌的分离培养 细菌的生化试验 动物试验 血清学试验 分子生物学方法 光学显微镜下细菌的形态 细菌的形态观察 光镜和电镜的比较 大肠杆菌 葡萄球菌 电镜镜检 光学显微镜镜检 培养结果 初次分离 纯培养 鉴别培养 不乳糖 发酵乳糖 麦康凯平板 不发酵乳糖的细菌 大肠杆菌，呈现黑色金属光泽 EMB平板 SS平板 大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌 有黑色中心的是沙门氏菌。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。 不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。 不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能