第六章植物原生质体融合技术黄秀梅.pptVIP

第29页，共55页，星期日，2025年，2月5日第30页，共55页，星期日，2025年，2月5日植物原生质体融合基本过程第31页，共55页，星期日，2025年，2月5日◆盐类融合法◆高Ca2+和高pH值融合◆聚乙二醇（PEG）融合法◆PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法◆电融合法第32页，共55页，星期日，2025年，2月5日A.盐类融合法盐类融合剂种类硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物类：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠盐类融合的优缺点优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合第33页，共55页，星期日，2025年，2月5日B.高Ca2+和高pH值融合Ca2+浓度0.05mol/LpH9.5-10.5第34页，共55页，星期日，2025年，2月5日具体做法(以烟草为例)取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h;用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值；两种原生质体的融合率达到10%。第35页，共55页，星期日，2025年，2月5日C.聚乙二醇（PEG）融合法Polyethyleneglycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH,平均相对分子量200-20000之间融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合用相对分子质量为1540的PEG处理40-50min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核体第36页，共55页，星期日，2025年，2月5日D.PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥）然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合）再用培养液洗去高Ca2+和高pH值第37页，共55页，星期日，2025年，2月5日PEG诱导原生质体融合过程第38页，共55页，星期日，2025年，2月5日E.电融合法原理： 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。优点： 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。第39页，共55页，星期日，2025年，2月5日第40页，共55页，星期日，2025年，2月5日第1页，共55页，星期日，2025年，2月5日◆What基本原理◆去除植物细胞壁以获得大量的原生质体◆诱导原生质体融合形成杂种细胞◆筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化◆从细胞团，愈伤组织到最后成株第2页，共55页，星期日，2025年，2月5日植物原生质体融合基本过程第3页，共55页，星期日，2025年，2月5日第4页，共55页，星期日，2025年，2月5日◆Why技术应用植物原生质体融合的意义：◆克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍◆为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件第5页，共55页，星期日，2025年，2月5日◆How植物原生质体融合技术方法植物原生质体的制备植物原生质体的培养植物原生质体的融合第6页，共55页，星期日，2025年，2月5日1、原生质体的概念及培养的意义2、原生质体材料来源3、原生质体的分离4、原生质体的纯化第7页，共55页，星期日，2025年，2月5日概念：除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体第8页，共55页，星期日，2025年，2月5日★植物叶片－取材容易－比较容易用酶解法分离★植物根尖组织－可由各种植物的种子萌发后取得★植物花粉－产生单倍体原生质体★愈伤组织、悬浮培养的细胞－细胞壁容易解离第9页，共55页，星期日，2025年，2月5日第10页，共55页，星期日，2025年，2月5日第11页，共55页，星期日，2025年，2月5日第12页，共55页，星期日，2025年，2月5日第13页，共55页，星期日，2025年，2月5日例:烟草叶肉细胞原生质体的分离1).材料的准备与消毒：2).酶解：3).纯化：4