第二章 一般组织化学技术PPT.pptVIP

标本制备技术:; 组织切片技术:（一）冰冻切片：;④浸蜡、包埋→ → ⑤切片玻片处理和涂胶： ;;;三、准备阶段： 1. 试剂、药品: 2. 动物: 3. 实验（模型）: 4. 标本制备（备用）: 四、组织化学反应： 五、观察、记录及结果统计分析： 六、查文献写论文：; 一般组织化学技术 一、酶组织化学 （一）基本概念及分类特点：; ① 酶蛋白是大分子，而一般催化剂 为小分子。 ② 酶具有高效的催化能力，其催化 效能比一般催化剂高很多倍。　　 ;③ 酶催化反应条件温和，近中性和常温下即可发生酶催化反应。 ④ 酶对催化的底物具有高度的专一性。 ⑤ 酶分子结构多种多样，其活性受体 内多种因素的调控; 分为六类： a. 氧化还原酶类： b. 转移酶类： c. 水解酶类： ; d. 裂合酶类： e. 异构酶类： f. 合成酶类: ;（二） 酶的保存及影响酶催化反应 的因素 1.酶浓度的影响： 2.底物浓度的影响： 3.激活剂浓度的影响：;抑制剂的影响： 根据抑制剂对酶的抑制作用不同： 不可逆性抑制： 可逆性抑制： 竞争性抑制： 非竞争性抑制： 反竞争性抑制： ;5. PH值对反应的影响： 最适PH值常表现于三个方面：  一是对Vmacr反应速度的影响。 二是对Km或对底物与酶的亲 和性的影响。; 三是对酶稳定性的影响。 确定最适PH的方法： 一是查阅文献，根据前人的经验， 预实验印证（碱性磷酸酶9.2，酸 性磷酸酶5.0）。 ; 二是实验测定最适PH值。 6. 温度的影响: 一是温度能影响酶分子结构的稳 定性及其与底物分子之间的亲和性。 ; 二是温度能影响酶底物复合物分解 速度。 三是温度能影响激动剂或抑制亲 和性。 （三） 显示酶的组化方法及原理 ; 在酶的显示方法中，从原理讲，可 分两大类： 一类是显示酶的活性—酶组织化 学方法：属于一般组化方法。 二类是显示酶的本质，即酶蛋白的 存在及存在部位—免疫酶组织化学。 ; 在???组织化学中，根据其反应原则， 显示酶的方法，可分为两类： 1.沉淀反应法： 主要用于显示分解酶类。 ;　又分两类： 　 ①金属阳离子沉淀法： S → 生成物中有基团+金属离子结 合→沉淀（有色）。 ②偶联偶氮沉淀反应法： S → 生成物中有基团+重氮盐→不 溶的有色沉淀（偶氮染料）。; 2. 电子传递法： 主要显示氧化酶和脱氢酶。 （四）组化中常用的酶类 ; 1. 标准和要求: （1）酶的纯度较高，容易获得且价格 低廉。 （2）当酶与抗体或抗生物素蛋白结合 后，酶的活性不变。 （3）结合后的酶分子在液相中能保持 ; 稳定。 （4）内源性酶的活性应受到最大限度 的降低，使之不能干扰与特异性抗原 相关的染色过程。 （5）酶反应的产物性质稳定，容易被 检测。 ; 2. 常用酶： （1）辣根过氧化物酶（HRP）：常 用HRP标记抗体。显色原有： ; ①DAB： H2O2→ H2O +O →+DAB →原位棕黄色沉淀。 ②AEC：氧化后玫瑰红色沉淀，易 溶于醇。 ③CN： 氧化后蓝色沉淀，易溶于醇 及有机溶剂，且易扩散。 ④H-Y试剂：氧化后蓝黑色沉淀。 ;（2）小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）： 显色原有： ① 固红TR：产物呈鲜红色。 固蓝BB：产物呈亮蓝色。 均易溶于醇和有机溶剂，故及时 处理切片。 ; ②新碱性品红（NF）： 产物呈红色,不易溶于醇和有机溶剂， 其显色强度高于固红TR 和固蓝BB 。 ;（3）葡萄糖氧化酶（尼腺曲霉菌素 源） 常用的显色原有： 　① 2-P-碘酚-3-P-硝基苯-5-酚氯化四 氮唑（INT）：产物呈红色，易溶于 有机溶剂。 ② 氮蓝四唑（NBT）：产物呈蓝黑 色。现用于双重染色。 ③四硝基氮蓝四唑（TNBT）：产; 产物呈灰褐色，不溶于有机溶剂。 （4）