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第二章 基因工程制药 Chapter 2 Gene Engineering for Pharmacon ;第一节、概述; A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来 源困难而供不应求； C、由于免疫抗原,病毒感染等缘故，使它们在使用上 受到限制。 ;1、可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白 质，为临床使用提供有效的保障；可避免免疫原 性及病毒污染（人生长激素 —克雅病CJD） 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生 理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物 质的应用范围； 3、利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性 生理活性物质； ;4、内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；白细胞介素-2,125半胱氨酸—丝氨 酸提高活性及稳定性；tPA缩小分子延长半衰期 5、 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。;三、基因工程药物发展简史;“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。;基因工程药物的种类;基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。; 制备基因工程药物的一般程序;基因工程药物的上游技术： 1、基因克隆载体:质粒载体， 2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的 载体DNA和待克隆的??酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。 1）用碱抽提法分离质粒DNA 原理：细胞pH12.0-12.6线状DNA变性，cccDNA不变性，加酸恢复pH到中性，变性的染色体DNA交织成网而沉淀，上清用酚处理使蛋白变性，用醇沉淀质粒DNA。 A）质粒DNA的小量制备 B）质粒DNA的大量制备 ;小量制备;2）染色体DNA的制备 3）真核细胞RNA的制备 DNA的凝胶(Agarose)电泳和 凝胶中DNA的 回收 5) SDS电泳和 凝胶中DNA的 回收; 第二节 目的基因的获得;一、化学合成法 较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。;人工化学合成基因的限制： a. 不能合成太长的基因。只适用于克隆小分子肽的基因。 b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。 c. 费用太高。 优点：可进行密码子的改造;一、逆转录法;1、mRNA purification;;2、合成第一链cDNA;;3、cDNA第二链的合成;3、合成第二链cDNA;全长cDNA链的合成;4、cDNA cloning：; 大肠杆菌质粒载体 ;;（2）pBR322质粒载体的优点 ;2．pUC质粒载体 ;（2） pUC质粒载体的优点 ;;噬菌体载体;5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）;cDNA文库的筛选;cDNA文库的建立过程;;利用文库克隆目的基因;;放射性探针进行得第一轮筛库;在对应的培养皿上挑出相应的噬斑;RTPCR法：;对已发现基因的改造;改造基因的方法：;课堂小结;作业