医学免疫学精品教学（复旦大学）实验六吞噬细胞功能测定 邵.pptVIP

实验六：巨噬细胞功能检测 邵红霞 李立婕 姜蔚 实验五结果分析 脾细胞总数少和活力低 原因分析/改进措施（多人计数） 美标的脾细胞分离方法 脾细胞计数和活力测定的方法准确性 ACK作用原理(氯化铵/胰酶)及加入PBS作用 动物伦理思考 巨噬细胞吞噬台盼兰染料颗粒？ 1．认识巨噬细胞吞噬现象的原理 2．熟悉细胞吞噬作用的基本过程 3．了解细胞吞噬实验的研究意义 实验目的 细胞吞噬作用原来是单细胞动物摄取营养物质的方式，也是原始防御作用。在高等动物中，发展成为单个核吞噬细胞和中性粒细胞两大类，专司吞噬作用，是固有免疫的重要组成部分。 血中的单核细胞和多种器官、组织中的巨噬细胞，两者构成单核吞噬细胞系统。 单核/巨噬细胞具有很强的吞噬能力，特别是巨噬细胞，在适应性免疫和固有免疫中均发挥重要作用。 基本概念 固有免疫：非特异性吞噬 获得性（适应性）免疫：细胞免疫（抗原提呈） 巨噬细胞 主要存在部位 形态学特征 1.向病原物趋化运动，伸出伪足 2.吞噬病原物形成吞噬体 3.初级溶酶体与吞噬泡发生融合，释放水解酶 4.杀死病原物，消化分解，排出体外 基本概念 巨噬细胞功能是衡量机体免疫能力的一个很重要指标 测定方法：主要是巨噬细胞的吞噬功能实验 本实验是通过小鼠腹腔巨噬细胞对酵母菌的吞噬来检测巨噬细胞的功能 实验用品 1．器材：显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、注射器、 载玻片、盖玻片、吸管等 2．试剂： 生理盐水、PBS、0.8%戊二醛（略）、 吉姆萨染色液。 3．材料：昆明种小白鼠、酵母菌（浓度为8*106/ml） 实验步骤 酵母菌悬液制备（已制备） 小鼠腹腔巨噬细胞悬液制备 吞噬试验 酵母菌悬液制备（已制备） 1. 培养并收集酵母菌 2. 用生理盐水调整菌液浓度到8*106/ml 3. 将菌液置于70℃水浴锅中加热20min以灭活酵母菌，置4 ℃冰箱备用。 小鼠腹腔巨噬细胞悬液制备 1. 用注射器吸取5ml PBS注射已脱颈椎致死的小鼠腹腔内，并轻柔按揉数次 2. 剪开腹部皮肤，钝性分离腹部皮肤，暴露部分腹腔 3. 用镊子小心夹起腹膜，用剪刀剪开一个小口，快速用吸管或移液器收集腹腔液于离心管中 4. 1500rpm,离心5min，弃上清，用300 ul PBS重悬细胞 实验步骤 用注射器 脱椎致死 吸取腹腔液 小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备 实验步骤 制作腹腔巨噬细胞涂片 在洁净载玻片上那个记号笔（蜡笔）画一直径约2cm的圆圈，圈内加一滴(50μL)酵母菌液和一滴(50μL)腹腔巨噬细胞悬液并混匀。 放入湿盒内，置37℃温箱孵育30分钟。 用NS轻轻冲洗并甩干，0.8%戊二醛固定5分钟，待干燥加Giemsa-Wright混合染色液和蒸馏水各1滴，染色2min。 自来水轻轻冲洗，待干燥后加香柏油于油镜下观察。 滴加染液试剂一3滴（盖没），染色90min，滴加试剂二6滴，混匀，染色6min 油镜：光学显微镜之一，使用时，镜头浸入油中（通常是香柏油），用于观察较细微的结构，是实验室常用的显微镜之一，清晰度略高于普通光学显微镜。 原理: 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 玻璃折射率（n=1.52） 香柏油折射率（n=1.515） 空气折射率（n=1.00） 油镜的使用方法 1. 10×物镜下找到清晰的视野； 2. 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油，将油镜转到位（浸入香柏油）。 3. 一边调节细调节旋钮，一边从目镜内观察，直到物象清晰。 4. 观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许无水乙醇（乙醚酒精），擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可。（注意向一个方向擦拭）。 实验结果 实验结果 结果观察与分析 计数100个巨噬细胞中吞噬酵母菌的巨噬细胞数和被吞噬的酵母菌的数目。计算吞噬细胞的吞噬指数和吞噬百分数。 吞噬酵母菌的巨噬细胞数 吞噬百分数= 100 巨噬细胞中吞噬的酵母菌的总量 吞噬指数= 100 x100% x100% 50个 注意事项 解剖小鼠时不能剪破腹腔，动作要轻柔迅速，以免巨噬细胞活性受到影响。 进行吞噬实验时，吸取酵母菌和腹腔巨噬细胞悬液时