医学免疫学精品教学（复旦大学）实验四 脾淋巴细胞分离邵.pptVIP

实验四：小鼠脾脏单个核细胞的分离 熟悉细胞分离的基本原理 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法 邵红霞 李立婕 姜蔚 实验二报告分析 阴性实验结果的原因分析 1. 指出最可能的原因 2. 思考补救措施 实验结果的呈现方式：结合图进行文字描述 实验讨论：1. 根据结果的描述，进行归纳总结，发现规律性的东西 2. 进行理论上的推导，与实际结果进行比较 3. 结合实验结果，探析可能的影响因素 4. 结合实验结果，分析实验误差原因 5.结合实验结果，进行合理化的建议 需要避免：讨论中，直接回答老师提出的问题或直接罗列实验注意事项或直接描述影响实验的因素，没有围绕自己的实验结果。感觉你的讨论在说别人的事，与你自己的实验无关。 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形态，属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环注入脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。 解剖图 胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠鼠龄越小，胸腺体积相对越大。 取脾脏 （一）取小鼠脾脏?（3~4人1组） 小鼠颈椎脱位处死 用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。 实验步骤 戴手套 解剖板 1 酒精消毒 减去皮肤 2 剪除腹膜 3 取出脾脏 4 分离脾脏 5 去除多余筋膜 6 平皿内事先加PBS 指套以滤网替代 7 针芯碾压 8 弃指套 9 移入离心管 可重复滤过 10 吹打混匀 加PBS 1 2 3 4 6 5 7 8 9 10 超净台下操作全过程 可重复滤过 （二）制备单个核细胞悬液： 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min； 弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。(放置冰上) 取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释） 以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度 注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力 实验步骤 塑料漏皿700目 （三）计算细胞浓度 将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 细胞计数： 细胞浓度（个/mL)=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数。 每个脾脏的总细胞数：细胞浓度（个/mL) ×10mL 实验步骤 每只小鼠脾脏细胞一般为1x107-2x108 计数时需要遵循一定的方向逐格进行以免重复或遗漏，对压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则。 （四）计算细胞活力 1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混匀； 2. 取一滴显微镜下观察： 如果细胞被染成蓝色，旋转显微镜微调节钮，细胞无反光，则为死细胞；而细胞不被染色，晶莹透亮，旋转显微镜调节钮，细胞明显反光而且有立体感，为活细胞； 3. 计算细胞活力：计数100个细胞中活细胞的百分率，一般活力应在95%以上。 死细胞 活细胞 细胞总数和细胞活力可以一起做 细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数 细胞活力=活细胞数/总数x100% 打开电源之前确认显微镜灯泡处于最弱处，结束观察后先把光线打最弱 打开电源，调节显微镜的光阑，基本原则： 低倍最弱、高倍适中、油镜最强 无色标本弱、染色标本强 3. 观察顺序，先低倍，再高倍，最后油镜 或：先低倍后直接转油镜 4. 显微镜镜头爱护：禁忌将镜头浸入腐蚀性液体中 实验结束后需要用擦镜纸蘸取乙醚酒精擦拭镜头（尤其是油镜） 5.油镜使用： （此次