医学免疫学精品教学（复旦大学）实验五 流式细胞术邵2017.pptVIP

二维等高图 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。 二维等高图 假三维等高图 （三）三参数散点图 免疫细胞分离方法： 根据细胞理化性质： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感 根据不同免疫细胞表面标志: MACS （Magnetic Activated Cell Sorting ） FACS（Fluorescence Activated Cell Sorting） 基本概念 人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。??? 密度梯度离心法 离心后 血浆 单个核细胞（PBMC） 粒细胞 红细胞 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。 以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。 MACS 正选 和 负选 正选 需要的细胞 标记需要的细胞 需要的细胞 标记不需要的细胞 负选 正选 只需要一种抗体 分离出的细胞纯度高 对于比例小的细胞群，正选容易得到高纯度 正选和负选的比较 优点 负选 需要的细胞没有被抗体等标记 对需要的细胞，不需要特异性的细胞标记 缺点 需要多种抗体标记不需要的细胞 需要特异性的靶细胞标记 可能引起细胞活化 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。 细胞分选原理 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴 含细胞的液滴 弃去 偏转落入收集器 压电晶体 产生机械振动 不充电 充电 分选基本原理 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。 分选的技术要求 原理：在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况 * 纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。 现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋势可归纳为： ①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪 ②?对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15?种荧光信号； ③从检测参数的相对定量发展为绝对定量； ④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析； ⑤?所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。 而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞