第四章 胚胎分割技术.pptVIP

胚胎分割技术 第四章　胚胎分割技术 第一节　概述 第二节　胚胎分割基本操作程序 第三节　胚胎分割的效果分析 第一节　概述 一、胚胎分割的概念： 　　　胚胎分割（embryo splitting)：是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术。 全能性（totipotenty），是指细胞能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即发育成完整动物体的能力。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。 内细胞团 第一节　概述 二、胚胎分割技术的应用 研究遗传、环境相互作用（一卵双犊） 避免牛的异性孪生不育 胚胎性别鉴定 与胚胎移植相结合可提高胚胎移植本身的效率，扩大优秀品种的后代数量，提高性能，加快品种改良和畜群增殖。 分割胚的冷冻保存法如能过关，则半胚可随意推迟移植时间，生产出不同年龄的一卵双胎，以用于各种试验。 第一节　概述 三、胚胎分割技术研究概况 　　　胚胎分割技术开始于Nicholas （1942）对大鼠2-细胞卵裂球的分离和培养。其后，Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球的发展规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。20世纪70年代以来,随着胚胎培养及移植技术的发展和提高,哺乳动物胚胎分割技术取得了突破性进展。目前胚胎分割的研究方向也正向着简单化和实用化发展。 　　　我国1986年张涌等首次利用胚胎分割方法获得同卵双生小鼠，1987年又获得同卵双生山羊。1986年窦忠英等获得分割胚牛犊，1990年又获得奶牛四分胚后代。1987年谭丽玲等获得同卵双生牛犊。 第二节　胚胎分割基本操作程序 一、切割器具的准备 二、胚胎预处理 三、胚胎分割 四、分割胚的培养 五、分割胚胎的保存和移植 第二节　胚胎分割基本操作程序 一、切割器具的准备 　　　体视显微镜、倒置显微镜、显微操作仪、胚胎固定管、切割针（玻璃针和微刀） 胚胎切割的工具 第二节　胚胎分割基本操作程序 二、胚胎预处理 　　　为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短期处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。 第二节　胚胎分割基本操作程序 三、胚胎分割 1、卵裂球分离培养法－－桑椹胚之前的胚胎 　　　将桑椹胚以前的卵裂胚去掉透明带，分离每个卵裂球，将其包埋于琼脂中，将包有卵裂球的琼脂柱，移到中间受体小鼠或兔的输卵管中，经数日活体内培养后，再取出已发育到多细胞的胚胎，移于受体子宫。 二、胚胎分割方法 毛细管吹吸法 2-到8-细胞期卵裂球（有的是16细胞，应在致密化之前） 1.透明带切口或除去 2.卵裂球二分 3.半胚注入到空透明带中 第二节　胚胎分割基本操作程序 2、桑椹胚或囊胚切割法 （1）致密化前各期胚胎的分割： 　　　根据胚胎的直径，制作适宜口径的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管，在显微操作仪上，用固定吸管固定住胚胎，然后用微玻璃针自上而下切开透明带，使其成为一个切口，将微吸管自切口处伸入，吸住半数卵裂球，慢慢取出，这样即可把胚胎一分为二。把吸出的半胚或卵裂球，纳入空透明带中，然后将分割后的胚胎包入琼脂柱，通过中间受体培养。 第二节　胚胎分割基本操作程序 2、桑椹胚或囊胚切割法 （2）桑椹胚至囊胚期胚胎的分割： 　　　使用微玻璃针或微刀就可分割桑椹胚，无需固定吸管。切割前需要对其进行透明带软化处理。经软化处理的胚胎，与少量培养液一起置于载片上，把针或微刀的刃部调节到胚胎的正上方，然后自胚胎的等分线向下移动，把胚胎轻轻压住，继续下切，胚胎就被压扁，继而被切开，再把切割的胚胎纳入空透明带。 分割桑甚胚无方向性，而囊胚则必须沿着等分内细胞团的方向分割胚胎。 四、分割胚的培养 为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。 早期胚胎切割后发育能力低，一般是经包埋后移植到中间受体的输卵管中培养几天至囊胚，再从输卵管中回收胚胎，最后移植给受体。 琼脂二次包埋 在含有20％血清的培养液中平衡一段时间后，用直径0.3-0.5mm的细管移入加热融化（30-37℃）的1％的琼脂中，吸出后在空气中停留数秒，稍微凝固（但仍是软的）后吹入培养液中，用27号注射器针头把琼脂条切短。 换用直径0.8-1.0mm细管移入加热融化的1.25％的琼脂中，再包埋一次，形成1.5-2.0mm琼脂固体长条。 琼脂：多孔，蓬松，不影响营养物质的吸收。 不采用体外培养的原因？ 体外培养时囊胚的发育能力低。 胚胎的发育阻断。 分割胚自身发育能力低。 体内培养时可采用中间受体的生理基础： 受精过程有种属特异性 但输卵管内的环境无种属特异性，不同物种的胚胎都可以培养。 移入假孕后或同期发情处理后的母畜的结扎的输卵管内，让其发育成囊胚。 从中间受体