HIF-1а及VEGF在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达及相关性.docVIP

精品论文 参考文献 HIF-1а及VEGF在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达及相关性 米明珊 官众（青海大学附属医院脊柱外科 青海西宁 810000） 【摘要】 目的 研究缺血再灌注损伤大鼠脊髓组织中缺氧诱导因子-1alpha;（HIF-1а）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达相关性以及两者在腰椎间盘退变过程中的意义。方法 3O只SD大鼠随机分为实验组(A组，15只)和对照组(B组，15只)，每组各分为6h、12h、48h组，每亚组各5只。采用Nas1und腹主动脉阻断方法建立脊髓缺血再灌注损伤手术模型。分别获取实验组、对照组不同时间点脊髓组织，采用免疫组化技术，显示出HIF-1alpha;因子、VEGF因子的表达状况，并描述缺血再灌注脊髓组织中HIF-1alpha;因子与VEGF因子的表达相关性。结果 HIF-1alpha;因子、VEGF因子在正常脊髓中表达很少或几乎不表达，而在缺血再灌注脊髓组织中二者表达均明显增加。HIF-1alpha;因子和VEGF因子在缺血再灌注脊髓组织中表达程度正相关（plt;0.01,r=0.625）。结论 在大鼠脊髓缺血再灌注脊髓组织中均表达增加，且HIF-1alpha;因子、COX-2因子表达存在相关性。 【关键词】 脊髓 缺血再灌注 血管内皮生长因子 缺氧诱导因子-1alpha; 脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCII)是原发性脊髓损伤的继发性损害，关于SCII的病理机制是目前国内外研究的热点问。近年来随着研究的深入，学者们发现血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF）作为一种血管生成肽，在脊髓缺血再灌注损伤后，通过改善局部微循环，可对脊髓神经起到保护作。另一方面大量研究表明因肿瘤增长迅速造成的局部缺血缺氧和营养的缺乏，促使缺氧诱导因子-1ɑ（Hypoxia- inducible factor-1alpha;，HIF-1ɑ）、VEGF两种因子表达增加，而这两种因子又可相互作用，对局部新生血管形成产生促进作用。本研究通过建立大鼠缺血再灌注损伤模型，在缺血再灌注后不同时间点，通过免疫组化法联合检测HIF-1ɑ、VEGF的在缺血再灌注中的表达情况，并通过统计学方法研究二者之间的表达的相关性， 一、材料和方法 1.试剂 试剂：HIF-1alpha;多克隆抗体(santa cruz )、VEGF多克隆抗体（北京博奥森）、一抗稀释液（北京博奥森）,即用型S-P超敏试剂盒（福州迈新） 2.方法 30只健康雄性SD大鼠随机分为实验组(A组，15只)和对照组(B组，15只)，每组各分为6h、12h、48h组，每亚组各5只。实验组采用Nas1und腹主动脉阻断方法建立脊髓缺血再灌注损伤手术模型。于左侧肾动脉分权下方放置阻断带阻断腹主动脉，以阻断下方动脉无搏动为标准。对照组麻醉和手术操作同实验组，但开腹只放置阻断带，而不阻断腹主动脉。分别获取实验组、对照组不同时间点脊髓组织，置于100ml/L中性福尔马林溶液，于4℃冰箱固定24h。石蜡包埋制成蜡块，连续切片，制成4mu;m病理切片。HIF-1alpha;、VEGF的表达均采用SP免疫组化技术测定：烤片，二甲苯、乙醇梯度脱蜡水化，抗原修复，滴加内源性过氧化酶阻断剂，滴加一抗，4℃冰箱过夜，滴加二抗，滴加链霉素抗生物素—过氧化酶溶液，DAB显色，苏木素复染，烘片、封片。 3.结果的判定 用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照:①HIF-1alpha;、VEGF因子以胞质、胞膜黄染为阳性判定标准，选取5个高倍镜视野，计算HIF-1alpha;、VEGF表达阳性细胞个数；②计数缺血再灌注脊髓组织中HIF-1alpha;、VEGF因子表达阳性细胞所占百分比（高倍镜下阳性细胞/所有细胞times;100%），并根据所占百分比及着色强度综合制定免疫组化半定量评分标准:（1）阳性细胞lt;1％ 0分；1％-10％ 1分；10％-50％ 2分；51％-80％ 3分；gt;80％ 4分。（2）着色强度计分：弱，1分；中,2分；强,3分。两个分值相加即为最终判定结果：1分（-）；2-3分（+）；4-5分（++）；6-7分（+++）。 4.统计学分析 所有统计学分析均采用SPSS17.0统计软件完成，计量数据用 -xplusmn;S表示，两组独立样本比较，方差齐采用t检验，方差不齐采用tˊ检验。HIF-1alpha;与VEGF的相关性分析采用Spearman等级相