利用荧光共振能量转移技术研究活细胞TLR4及MD-2作用结构域.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(11): 145 1~ 1457 用荧光共振能量转移技术研究活细胞TLR4 与MD 2 作用结构域* ** ** 田雨 唐 靖 陈登宇 刘亚伟 王 蔚 刘靖华 姜 勇 (广东省功能蛋白质组学重点实验室，南方医科大学，广州5 10515) 摘要 脂多糖(LPS) 的识别和信号转导是宿主发生防御反应的关键，Toll 样受体4(TLR4)与髓样分化蛋白-2(MD-2)形成复合物 在LPS 的识别及其信号转导中发挥了重要作用 研究TLR4 与MD-2 结合的功能结构域，对于深入了解LPS 信号转导机制及 其内毒素休克的防治具有重要意义 运用基于强度的三通道荧光共振能量转移技术(FRET)及基因突变和转染技术，研究了活 细胞TLR4 与MD-2 作用的结构域 结果表明：N 端Glu24～Met41 缺失使TLR4 与MD-2 结合能力明显下降；LPS 刺激后 TLR4 聚合迅速增加，而缺失Glu24～Met41 的TLR4 不能聚合 上述结果提示，TLR4 的Glu24～Met41 不仅是结合MD-2 的区 域，并且还参与了LPS 刺激后TLR4 的聚合作用 关键词 TLR4 ，MD-2，脂多糖(LPS)，荧光共振能量转移技术(FRET)，信号转导 学科分类号 Q288 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00246 - 革兰氏阴性(G )菌感染引起的脓毒 (sepsis)是 [1] 1 材料与方法 严重创伤、烧伤和手术病人常见的致死原因 脂 - 多糖(lipopolysaccharide, LPS)是G 菌细胞壁的主要 1.1 材料 成分，也是其致病的关键结构 由于LPS 的识别 1.1.1 质粒、菌株和细胞 带有TLR4 信号肽编码 - 和信号转导是宿主对G 菌发生防御反应的关键， 序列的pECFP-SP、pEYFP-SP、pECFP-SP-MD-2、 所以对LPS 信号转导的研究一直是相关领域的 pECFP-SP-TLR4、pEYFP-SP-TLR4 由本室构建并 [2] 热点 大量研究表明，Toll 样受体4 (Toll-like [9] 保存 ；大肠杆菌菌株DH5 ，HEK 293 细胞，HeLa receptor 4, TLR4)在识别和转导LPS 信号中具有关 细胞均由本室保存 键作用[3, 4] 进一步研究发现TLR4 对LPS 的识别 1.1.2 试剂 DNA 纯化回收试剂盒、质粒小量抽 和信号转导依赖髓样分化 蛋白 -2 (myeloid 提试剂盒、PolyFect 转染试剂盒均购自QIAGEN 公 [5] differentiation protein-2, MD-2) 的参与 MD-2 能与 司；限制性内切酶(