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β1，4－半乳糖基转移酶I影响雪旺氏细胞增殖机制 　 作者：肖锋，季玉红，沈爱国 严美娟 刘海鸥 孙琳琳 【摘要】 目的：探讨β1，4－半乳糖基转移酶I影响雪旺氏细胞增殖的机制。方法：将不同浓度的β-1,4-GalT-I表达质粒转染雪旺氏细胞，采用Western blot方法检测增殖相关信号分子cyclin D1、p16INK4以及p27Kip1的表达水平，Northern blot方法检测p19ARF的表达变化。结果：随着β-1,4-GalT-I在雪旺氏细胞中的表达增加，cyclin D1表达降低，而p16INK4a 和p19ARF呈现相反的变化；p27Kip1变化不明显。结论：β-1,4-GalT-I影响雪旺氏细胞增殖可能与cyclin D1、p16INK4a和p19ARF介导的信号传导途径有关。 【关键词】 β1，4－半乳糖基转移酶I；雪旺氏细胞；增殖；大鼠 　　雪旺氏细胞是周围神经系统的主要胶质细胞，在周围神经的发育与再生过程中起重要作用。已有研究发现转染β-1,4-GalT-I后引起雪旺氏细胞增殖抑制，并且导致细胞周期阻滞在G1/G0期[2]。本实验通过检测调节细胞周期的相关信号分子，初步探讨β-1,4-GalT-I抑制雪旺氏细胞增殖的分子机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验动物 新生1～2 d SD大鼠60只，由南通大学动物中心提供。 　　1.1.2 实验试剂 培养板、胰蛋白酶、胶原酶、胶原、多聚赖氨酸(上海华美生物制品公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；forskolin、阿糖胞苷、IgM型抗Thy1.1、兔补体（美国Sigma公司）；抗p16INK4a、抗p27、抗cyclin D1单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；pcDNA3.1载体、LipofectawinTM2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；胶回收试剂盒（上海华舜公司）；PCR试剂盒（大连TaKaRa公司）； Prime-a-gene试剂盒（美国Promega公司），表达质粒pcDNA 3.1—β-1,4-GalT-I由复旦大学上海医学院基因研究中心惠赠。 　　1.2 方法 　　1.2.1 分离、纯化雪旺氏细胞 无菌条件下取出新生大鼠坐骨神经，用0.25％胰蛋白酶/0.03％胶原酶消化，先在含阿糖胞苷(Ara-C，5mmol／L)的培养液中培养48 h，洗净Ara-C 12h后，再进入含Ara-C培养液中培养24 h，而后在正常培养液中培养。成纤维细胞通过补体介导的细胞毒作用而消除，方法为：IgM型抗Thy1.1(1∶200)作用30min，洗净抗体后，用兔补体(1∶200)作用30min。以后细胞进入含Forskolin(2 μmol／L)的培养液中，每2～3d更换培养液1次。 　　1.2.2 Western blot 在分离、纯化的雪旺氏细胞转染正义β-1,4-GalT-I表达质粒和pcDNA 3.1空载体（5、10、20、40μg/孔，6孔板）3天后收取细胞蛋白。改良Lowry法进行蛋白定量后，经10%SDS凝胶电泳分离蛋白。转膜后，以5%TBST脱脂奶粉封闭液室温封闭2h ，抗p16INK4a（1∶1000稀释），抗p27 (1∶1000稀释），抗cyclin D1（1∶1000稀释）4℃孵育过夜。相应HRP偶联的二抗（1∶2000稀释）室温孵育2h。洗涤后以ECL发光底物显影，分别显示p16INK4a、p27、 cyclin D1蛋白表达水平。GAPDH作为内参。 　　1.2.3 p19ARF和β-1,4-GalT-I DNA模板的制备 p19ARF引物 上游，5’-GTAATGCCACTGCTGGGAGA -3’；下游， 5’-ATGTGGCTGCGGCCCTCT- 3’。β-1,4-GalT-I引物：上游，5-TTACTCECCAAGGACTGTG-3’；下游，5-CTCTTGAAGCCGGATCATT-3’。 　　1.2.4 Northern blot的探针标记 根据试剂盒要求(Prime-a-gene)标记探针。 　　1.2.5 Northern blot分析 分别取β-1,4-GalT-I表达质粒和pcDNA 3.1载体不同转染浓度的雪旺氏细胞进行总 RNA 提取，40μg RNA上样，行甲醛变性胶电泳。转膜后，将膜用杂交液(含1.0mmol／L EDTA，1％BSA，7％SDS，15％甲酰胺) 65℃预杂交4h，加入变性的标记探针，65℃杂交16h。洗膜、压片、-70℃放射自显影，5～7d后，洗片。 　　　2 结果 　　正常未转染和转染pcDNA 3.1空载体（5、40μg/孔）作为空白对照，将不同浓度的正义β-1,4-GalT-I表达