γ射线及LPS作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7生物学效应.docVIP

γ射线及LPS作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7生物学效应 　作者：饶亚岚, 丛 悦, 陈肖华*, 董波, 李峰生, 张军权, 高玲, 毛秉智 【摘要】 目的: 研究γ射线与LPS协同激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的效应机制, 以及γ射线与LPS诱导钙结合蛋白S100A8的表达及意义。方法: 相差显微镜观察细胞形态; 流式细胞计数方法检测细胞周期及活性氧介质（ROI）水平; Griess颜色反应测定细胞NO水平; 实时定量RTPCR方法检测细胞S100A8 mRNA水平的表达。结果: γ射线与LPS作用于RAW264.7细胞引起细胞形态改变, 部分细胞出现非整倍性, 少量细胞出现凋亡, 胞内ROI水平、 NO水平明显升高, S100A8 分子mRNA水平明显升高, 而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。结论: γ射线与LPS协同诱导巨噬细胞激活是细胞周期改变、 信使分子水平变化、 炎症因子如S100A8的表达等多方面生物效应的综合结果, 其中S100A8基因的表达与巨噬细胞功能状态密切相关。 【关键词】 巨噬细胞; γ射线; LPS; S100A8 巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用, 辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常, 巨噬细胞的辐射效应一直受到重视。巨噬细胞通常具有辐射抗性, 但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞。一氧化氮（nitric oxide, NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志, 单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞J774.1和RAW264.7细胞中NO水平的改变, 但0.5～10 Gy 射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素γ（interferonγ, IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导生成NO, 而且呈现剂量效应关系［1］。 钙结合蛋白S100A8是S100蛋白家族成员, 是一个多功能分子, 其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］。Stassen等［3］研究发现, 6 Gy X射线照射MCF7细胞后48～72 h, S100A8被诱导表达, 其 mRNA水平呈现辐射剂量效应关系。静息态的巨噬细胞不表达S100A8, 激活状态的巨噬细胞才表达S100A8分子, S100A8在巨噬细胞中为LPS等炎症因子诱导表达［4］。既然S100A8能够为电离辐射及LPS诱导表达, 那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中, 电离辐射是否与LPS协同诱导S100A8以及S100A8的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系。本研究观察比较了RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h, 5 mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态、 周期、 活性氧介质（reactive oxygen intermediates, ROI）水平、 NO水平及S100A8 mRNA等指标的改变并探讨相互之间的关系。 1 材料和方法 1.1 材料 试剂LPS、 27’二氯荧光素双醋酸盐(2, 7dichlorofluorescin dictate, DCFHDA)、 碘化丙啶(propidium iodide, PI)为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基干粉、 胎牛血清、 TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品。随机引物、 MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品。BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit为杭州博日公司产品。FACS Calibur 流式细胞仪为美国BD公司产品。Linegene荧光定量PCR检测系统为杭州博日公司产品。 1.2 方法 1.2.1 RAW264.7细胞培养及处理 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液, 37℃、 50 mL/L CO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24 h, 换新鲜培养基, 不辐射或10 Gy 60Co γ射线照射, 照射后24 h, 不加或加入5 mg/L LPS, 继续培养24 h。相差显微镜观察细胞形态变化。 1.2.2 流式细胞术测定细胞周期 乙醇固定骨髓单细胞悬液, PI染色, 流式细胞仪检测, 具体按文献［5］进行。 1.2.3 流式细胞术测定ROI水平 约1×106 RAW264.7细胞铺种于6孔板中, 培养过夜, γ射线或(和)LPS处理后不同时间收集细胞, 用无血清RPMI1640培养液洗2遍细胞后, 20 μmol/L DCFHDA悬浮细胞, 37℃孵育30 min, 无血清RPMI1640培养液洗涤1遍后, 0.5