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RNA干扰在乳腺肿瘤治疗中探究进展 　 作者：王明玉 王文静 宋现让 【关键词】 RNA干扰；基因治疗；乳腺肿瘤 RNA干扰(RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)介导细胞内的同源mRNA发生特异性降解,导致靶基因表达沉默，产生相应功能表型缺失。这一现象属于转录后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)机制。RNAi是广泛存在于生物界的古老现象,是生物体抵御病毒或其他外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制,是包括人类在内的从低等真核生物到哺乳动物体内天然存在的基因沉默机制，其抑制靶基因表达的效率远比反义核酸高，持续时间也更长,具独特优势及广泛的应用前景〔1〕。1998年Fire〔2〕和他的同伴在线虫中首次发现RNAi现象以来,陆续有报道在植物和果蝇等其他各种生物中也发现了RNAi现象。目前普遍认为RNAi是机体细胞一种强有力的基因调控机制。典型的RNAi技术基本上对任何mRNA系列都有非常高的成功率〔3〕。但是在哺乳细胞中导入外源大分子dsRNA (gt;30个碱基) 常常导致非特异性的基因沉默效应,因为它激活了核糖核酸酶而导致非特异性的RNA降解,2001年Elbashir〔4〕等证实在哺乳动物细胞中存在RNAi现象,介导RNAi的中间物质是小干扰RNA(siRNA)，siRNA小于30个碱基，不激活核糖核酸酶,而是通过序列特异性的方式诱导基因沉默效应，揭开了RNAi应用于哺乳动物和人类研究的新篇章。 　　1 RNAi的机制 物种之间RNAi的作用机制虽然有差异,但都要经历起始阶段和效应阶段两步生物进化上保守的过程〔5〕。在起始阶段,与内源性mRNA互补的各种方式产生的dsRNA进入细胞后,与一种核酸内切酶Dicer结合并被Dicer切割成21～23个碱基长的小片段。Dicer是核酸内切酶家族中特异识别dsRNA的酶,它以三磷酸腺苷(ATP)依赖的方式从dsRNA的钝头或3′端有小悬突的dsRNA上开始切割,然后再形成5′末端为磷酸基，3′末端为羟基并含有2个突出的单核苷酸的21～23个碱基长的片段,这些小片段就是siRNA。在效应阶段，一部分siRNA与Dicer形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC再与目的基因转录出的mRNA结合并降解该mRNA。这也是一个需要能量的过程。RISC以内切的方式降解mRNA,并且只是降解与siRNA互补的那部分序列,因此RNAi有很高的序列特异性。另一部分siRNA则作为引物,帮助RNA依赖性RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RdRp)以mRNA为模板合成新的dsRNA,这些新合成的dsRNA又可以与Dicer结合并被切割成siRNA,从而产生级联放大效应，因此只要微量的dsRNA就可以引起RNAi〔6〕。 　　2 RNAi技术的应用 　　2.1 RNAi技术在基因功能研究中的应用 　　RNAi作为一种新的方法,在基因功能的研究上呈现出巨大的应用前景,提供了一种高通量分析的途径。Fraser等〔7〕与Gonczy等〔8〕曾采用此方法证实了线虫染色体Ⅰ和Ⅲ中早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等有关的所有基因功能，并在约19 000个基因的线虫蠕虫中,构建了12 000种不同dsRNA文库用于研究其与复杂生命现象相关的基因的功能,如肥胖、衰老等。运用化学合成的siRNA可帮助确定脊椎动物基因的功能,而且已扩展至人类细胞的体外研究。Semizarov等〔9〕运用RNAi技术沉寂Rb1基因,其编码产物是细胞周期调控的关键因子,结果细胞周期中G1/S和G2/M期的转换、DNA的复制和修复、有丝分裂、凋亡均受到影响。通过构建短的RNA文库或编码siRNA的DNA载体,已经分析了8 000个人类基因的功能。其与基因芯片等技术结合,可高通量地分析各基因的功能，RNAi在细胞中具有抑制或灭活特异基因的功能,可以产生类似基因“敲除”的效应,是功能基因组研究的有效工具,这一技术比基因敲除技术具有明显投入少、周期短、操作简单等优势,它的应用将为基因功能的研究开辟新途径〔10〕。 　　2.2 RNAi在基因治疗中的运用 　　由于RNAi是针对转录后阶段的基因沉默,相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个流程设计更简便、迅速、有效,为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制,控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。 　　2.2.1 RNAi在抗病毒感染疾病中的运用 　　RNAi技术在丙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒〔11〕、呼吸道合胞病毒、人类乳头瘤病毒〔1