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RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2表达 　【摘要】 构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2 mRNA及蛋白表达的影响。方法利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建pSilencerHER2重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3。RTPCR分析HER2 mRNA的表达,Western blot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况。结果酶切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2 mRNA及蛋白的表达,抑制细胞的增殖。结论构建的pSilencerHER2重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略。 【关键词】 RNA干扰 受体 表皮生长因子 乳腺肿瘤 瘤细胞 培养的 基因表达 表皮生长因子受体2(HER2)在包括乳腺癌在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达,与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切[1],是极具发展前途的基因治疗靶位。约有30％乳腺癌患者伴随有HER2及其基因产物的过表达[2],HER2过表达是乳腺癌病人不良预后的重要标记物。RNA干扰是近年来发展起来的基因阻断技术,它通过将双链RNA(doublestranded RNA,dsRNA)导入细胞后,在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),与该段RNA同源mRNA产生特异性降解,从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象[3]。笔者采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人乳腺癌细胞株SKBr3细胞HER2的表达,探讨利用质粒表达载体体内合成siRNA的方法能否有效介导肿瘤细胞出现RNAi，从而为乳腺癌的基因治疗提供新策略。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1细胞株SKBr3细胞(人乳腺癌细胞株，湖南远泰生物技术有限公司)。 1.1.2主要试剂MMuLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶(立陶宛MBI公司);质粒pSilencerTM3.1H1 neo(美国Ambion公司);限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4DNA连接酶、100 bp DNA ladder(大连宝生物技术公司);RMPI 1640培养基、Trizol和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);MTT(美国Sigma公司);鼠抗人HER2单克隆抗体(美国Ramp;D公司);TMB Western Blot试剂盒(美国KPL公司)。 图1pSilencer质粒图谱 Fig 1pSilencer plasmid map 1.2方法 1.2.1构建短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒根据GenBank数据库提供的HER2基因序列(NM004448),按照siRNA的设计原则,利用Ambion公司在线设计软件设计siRNA序列,筛选出1个19核苷酸的靶序列,用siRNA Hairpin寡核苷酸序列设计软件设计成双链发夹结构,双链的5端引入BamHⅠ位点,3端引入HindⅢ位点,中间9个核苷酸是用于形成发夹结构,在3端有一个TTTTTT的终止信号。 DNA正义链： 5GATCCGGACATCTTCCACAAGAACTTCAAGA GAGTTCTTGTGGAAGATGTCCTTTTTTGGAAA3’ DNA反义链： 3GCCTGTAGAAGGTGTTCTTGAAGTTCTCTCA AGAACACCTTCTACAGGAAAAAACCTTTTCGA5’ 由大连宝生物工程公司合成,2条DNA链退火形成双链DNA,与线性化载体在16 ℃连接过夜,无义对照质粒由美国Ambion公司提供,转化感受态大肠杆菌。随机挑选转化菌落,小量提取质粒,进行酶切鉴定,鉴定正确的shRNA重组质粒(pSilencerHER2)进行测序。 1.2.2细胞培养人乳腺癌细胞SKBr3,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基,于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中常规培养和传代。 1.2.3细胞转染转染前1 d,将SKBr3细胞接种6孔板,每孔3×105,3 mL,置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养过夜,待细胞生长融合达85%~90%后,采用siPORT XP1试剂(美国Ambion公司)按说明书方法进行转染,每孔加入脂质体2.0 μL和重组质粒pSilencerHER2 1.0 μg,同时转染无义质粒(pSilencerneospecial)作为对照。转染48 h后检测目的基因的表达。 1.2.4RTP