三七皂甙Rb1 对急性呼吸衰竭大鼠的影响及作用机制的讨论.docVIP

三七皂甙Rb1 对急性呼吸衰竭大鼠的影响及作用机制的讨论 　　三七总皂甙( Panax Notoginseng saponins，PNS)是中药三七的主要有效成分，在心血管系统、呼吸系统、神经系统及免疫系统等多方面具有良好的药理作用，临床应用广泛，具有良好的新药开发价值。其中，三七皂甙R1、人参皂苷Rg1 和三七皂甙Rb1是公认的代表性成分。陆燕等认为三七总皂甙及其主要成分Rg1、Rb1 等对急性呼吸衰竭有一定的保护作用。目前对三七皂甙Rg1 的研究很多，但是对三七皂甙Rb1 的研究甚少，而且机制尚不明确。严重感染、创伤、休克后，常出现以呼吸窘迫和低氧血症为特征的一种急性进行性呼吸困难，为临床常见的危重症之一，死亡率很高，急性肺损伤严重威胁人类健康，是目前医学界研究的一个热点。本试验采用舌静脉注射内毒素脂多糖复制大鼠急性呼吸衰竭模型，用荧光偏振法检测肺脏线粒体膜电位和膜的微黏度。用RT-PCR 测定细胞色素氧化酶( cytochrome oxi-dase，COX) ⅡmRNA 表达的变化，用[3H]油酸标记的大肠杆菌作为底物，测定急性呼吸衰竭大鼠分泌性磷脂酶( secretory phospholipase，sPL) A2 活性的变化。从三七皂甙Rb1 对急性呼吸衰竭的影响方面入手，旨在为研究三七皂甙Rb1 治疗呼吸系统疾患，特别是急性呼吸衰竭提供尽可能详尽的实验依据和理论基础。 　　1 材料与方法 　　1. 1 主要试剂 　　三七皂甙Rb1 购自昆明植物研究所。Hepes、IV 型胶原酶、胰蛋白酶抑制剂、Percoll、均购于sigma公司。1. 2 实验动物雄性Wistar 大鼠40 只，体质量( 200 plusmn; 10) g，动物购自河北医科大学动物实验中心，合格证号: 翼医动字号04056。 　　1. 3 动物模型的制作 　　健康Wistar 大鼠40 只随机分为4 组: 正常对照组、呼吸衰竭模型组、Rb1 低剂量组( 5 mg /kg) 、Rb1高剂量组( 10 mg /kg) ，每组10 只。采用舌静脉注射内毒素脂多糖复制大鼠急性肺损伤模型，于大鼠急性肺损伤3 小时后给予Rb1 治疗3 小时，断头放血处死。 　　1. 4 标本采集 　　4 组大鼠按不同指标所需时间从尾静脉收集血液分离血清，放置- 20℃储存。迅速取出大鼠肺脏，低温差速离心法提取肺脏组织线粒体，测定线粒膜的流动性及膜的微黏度，测定sPLA2 活性的变化，测定COXⅡ的表达。 　　1. 5 线粒体膜流动性的测定 　　取新鲜肺脏组织，按照文献并加以改进，用差速离心法获得线粒体，将线粒体悬浮在1. 5 mL 分离递质中，卡马氏兰测定蛋白质含量使蛋白质浓度为5 mg /mL，采用荧光标记与荧光偏振法，激发光波362 nm，发射光波长432 nm，在荧光分光度计上( 加偏振片) 测定膜荧光偏振度( P) ，按公式eta; =2p /0. 46 - P，求出平均微粘度，用于膜流动性的测定。 　　1. 6 COXⅡ表达的测定 　　1. 6. 1 引物的合成参照文献细胞色素氧化酶Ⅱ( COXⅡ) 上游引物序列: TCGACCCCCTACAACTGGTTTCAAGG，下游引物序列: AAATCATGTGGATGTGTCTAGTTGTGGC;beta;-actin( 管家基因) 上游引物序列: AAATCGTCGGTGACATCAAA，下游引物序列:ATCGTACTCGTGCTTGCTGA。 　　1. 6. 2 总RNA 的分离应用Tripure isolation reagent( Roche) 分离细胞总RNA，按说明书要求操作。1. 6. 3 RT-PCR 检测COXⅡmRNA 的变化应用日本宝生物公司TaKaRa RT-PCR Kit( AMV) 检测，按要求操作。琼脂糖凝胶电泳检测: 紫外灯下观察，凝胶成像系统扫描存盘。记录各条带积分光密度( IOD) ，将各个检测基因与自身beta;-actin 条带IOD 相比较得到其相对IOD。 　　1. 7 sPLA2 活性的测定: 　　参照文献制备的[3H]油酸标记的大肠杆菌为sPLA2 的底物。测定时取上清液100 mu;L 加闪烁液6 mL，避光静置12 小时作液闪计数。sPLA2 单位定义: 以每升样品37℃每分钟水解1 nmol 磷脂量为1个单位。 　　1. 8 统计学分析 　　各组数据用SPSS 16. 0 统计软件分析进行数据处理，计量资料用均数plusmn; 标准差( x plusmn; s) 表示，Rb1 对大鼠肺上皮细胞线粒体膜流动性的比较、各组大鼠肺上皮细胞线粒体编码基因COXⅡ表达的变化、呼吸衰竭大鼠肺脏线粒体sPLA2