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Stx 噬菌体病毒相关特性及Stx 毒素的诱导特征 摘要 大肠杆菌O157 是产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）的主要血清型，可以引起人和动物的腹泻、 出血性结肠炎，并可以进展为溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少 性紫癜。已知产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子主要有 LEE(Locus of enterocyte effacement)毒力岛、溶血素、耐热肠毒素和志贺毒素 （Shiga toxins, Stxs）。Stxs 在100 多个血清型的大肠杆菌中发现， 它们是 STEC 的主要毒力因子之一。Stxs 包括两个生物型：Stx1 和 Stx2，它们大都由溶源性噬菌体（Stx 噬菌体）编码，Stx 噬菌体的 溶源转换与细菌分泌Stxs 以及细菌毒力密切相关。所以对Stx 噬菌 体相关特性及 Stx 毒素诱导特征的研究有助于揭示噬菌体介导的毒 力基因水平传播与毒素释放之间的相关性，从一个全新的、本质的角 度来监测、预防、控制STEC O157 的感染。 本试验采用二重PCR 对62 株大肠杆菌菌株进行stx 基因检测， 筛选到8 株同时含有stx1 和stx2 基因的O157 菌株，将这些菌株应 用丝裂霉素 C 进行噬菌体诱导，MC1061 作指示菌检测滤液中的噬菌 体，PCR 检测滤液中噬菌体DNA stx 基因。制备抗大肠杆菌素的突变 株MC1061(colicin)和Stx2 噬菌体的溶源菌株MC1061(colicin)：： Stx2，利用MC1061(colicin)：：Stx2 作为指示菌筛选滤液中Stx2 噬 III 菌体以外的噬菌体。并对其中一株Stx2 噬菌体A 亚单位进行测序验 证。结果显示8 株大肠杆菌O157 溶源菌株经丝裂霉素C 诱导后均优 先释放Stx2 噬菌体，不释放Stx1 噬菌体。通过多次纯化，获得8 株 Stx2 噬菌体。通过比对发现Stx2 噬菌体ΦPB0308-2 A 亚单位核苷酸 序列与GenBank 中多株Stx2 噬菌体（X07865、AP005154、AF548457、 AP000363）相应序列的同源性高达 99％。本试验不仅鉴定了大肠杆 菌O157 溶源菌株诱导后优先释放的是Stx2 噬菌体，验证了stx 基因 在大肠杆菌菌株间的水平转移，同时还建立了指示多种Stx 噬菌体的 优化方法，将有助于对Stx 噬菌体的进一步研究。 将实验室分离的8 株Stx2 噬菌体作为试验材料进行相关特性研 究。采用随机引物法（Dig－dUTP）标记了789bp 的 stx2 基因片段 作为探针进行 Southern blot。测定Stx2 噬菌体增殖效价、将其中 的6 株噬菌体进行电镜观察，并对其基因组大小、酶切片段的多态性 和蛋白质组成进行了初步分析。Southern blot 结果进一步验证了该 8 株噬菌体均为Stx2 噬菌体，各噬菌体的增殖效价高，从108PFU/mL～ 1010PFU/mL 不等。电镜下观察到的6 株 Stx2 噬菌体形态基本一致， 头部均为正六边形，尾部很短。各噬菌体之间存在着相同的蛋白结构 模式，但是限制性内切酶片段长度表现出一定的多态性，噬菌体的基 因组大小从48.0kb～65.3kb 不等。 Stx2 噬菌体能够介导 stx 基因在大肠杆菌菌株间的水平转移， 而某些抗生素又能诱导Stx 噬菌体的释放，但抗生素对Stx 毒素的诱 导作用还没有一个明确的结论。本试验选用丝裂霉素C 作诱导剂，研 IV 究了诱导前后以及诱导后8h、12h、16h 四个阶段滤液中Stx 的表达 量，毒素表达量采用WST-1 细胞毒性检测试剂盒检测Vero 细胞存活 率的方法。试验结果显示各阶段之间Vero 细胞存活率的差异极显著 （P＜0.01），不仅诱导前后细胞存活率差异极显著，而且诱导 8h、 12h、16h 之间细胞存活率差异也极显著。诱导后 Stx 毒素的表达量 显著增加，且随着诱导时间的延长毒素的表达量继续增加，但增加的 幅度逐渐减缓。本试验确定了丝裂霉素C 可以诱导细菌Stx 毒素的表 达，增强细菌的毒力。 关键词：Stx 噬菌体，鉴定，特性，丝裂霉素C，Stx 毒素