asia-ⅰ型蹄疫病毒p1-2a和3cd基因及il-18基因重组腺病毒载体的构建.pdfVIP

摘 要 口蹄疫(F00d—and-MouIh 和我国政府列为A类和…类传染病之首。为了给FMD的防控提供更安全、高效的防控产品，本研 陷型人5型腺病毒载体重组，成功构建了重组腺病毒载体。为Asia_l型口蹄瘦病毒躲病毒活载体疫 苗的研究积累了基础数据。 1)克隆了Asia—I型口蹄疫病毒P1．2A和3CD基因。序列测定表明：P1—2AK2247bp，编码 株进行比对，该毒株与IND吡和云南宝山毒株的序列同源性相对较高，Pl一2A基冈核茴酸序列同 源性分别为92．5％和84．9％，与矾D01毒株属于同一基因亚型。 2)将目的基因剃穿梭载体用相应的内切酶酶切后连接，将阳性的重组腺病毒穿梭质粒用Pmel 单酶切线性化后与腺病毒骨架载体在BJ5183细胞中进行同源重组，将鉴定为刚性的重组腺病毒 质粒转化DH5a感受态菌用于扩增，用于转化293细胞包装成熟重组腺病毒。止确的重组有二种 方式即左右臂之间同源重组和起始点与右臂同源重组，酶切可以切出35Kb的人片段和3．oKb或 4．5Kb的小片段。本实验中切出35Kb、和4．5Kb的条带，为起始点与右臂同源重组。 3)用线性化的重组腺病毒转染293细胞，获得基因组结构均一的重组腺病毒。将鉴定阳性的 重组腺病毒质粒用Pad酶切线性化借助脂质体转染至293细胞，7天左右包装成成熟的重组腺病毒。 用此重组腺病毒再次感染293细胞，2．3天后可见细胞病变(a)E)，病变细胞涨火变圆、聚集，产 生典型的腺病毒葡萄样病变。测定第10代重组腺病毒的毒价为10““TCID5棚．1111l 4)将重组腺病毒在豚鼠中进行了初步免疫效力试验。将传代稳定，毒价高的重组腺病毒处理 厉用于免疫豚鼠，定期采皿，用间接EuSA法测定血清抗体，结果表明在豚鼠体内有FMDv抗体产 生，但滴度不是很高，用同型口蹄疫病毒攻击作保护性实验，结果重组腺病毒免疫组的3只豚鼠中 有2只得到了完全保护。 关键词：口蹄疫，口蹄疫病毒，自介素一18，腺病毒载体，同源重组，疫苗 ABSTRACT F∞莲嘲d一黻越l逊蘸{s。a鹊疆酣D)is a o辩对嫩e嫩os￡i掰pof酶聪强i强垂畦i转ases，铀稿l鼯殖e瓣se cloVen．hoofedanim出．1i hig}1王ycomagiou$diseaSea王船甜ing is靶deemedaslhemstanimaidiseasebv theworldO憾andour Ihe best we co咖lry．FDrprovidingproductsconstructedarecombinant h辑manadenov虹us 5vec}or feplica噍瑚一de如c|ion v{确l ser。{ype c。箍t氇i娃ngFMDV锚ps|d，Pl一2A，8馥d a垂i《s。蠡圩疆e球$e襄}馥。萋黼 3c王≥筘。把ase∞d妇誊嚆b矗s琏娃diL-i嚣萨辩，剥，fchc曩娃季释鳓辨e adenoviusveclor as vaccine．Re辩archf。l】ow： Ihe cloned P1-2Aa姒3CD 1)we Ibl8 successfully gene粕d gene硝A8ia—Ify弘荆DV．By 7裙蕊{B。acids。3国 m窭Bs珏斌i曩霉垃攮seqH。nce粥如杜nd矗鞋Pl一2A器嘴bs22辛了殛，w毯吐eo如s