tgevs基因和c抗原位点片段的原核表达及5’端核酸探针制备.pdfVIP

摘要 virus，TGEV)是冠状病毒科、 猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis TGE)，死亡率 冠状病毒属成员，引起猪的传染性胃肠炎(Transmissiblegastroentefitis 很高，呈世界范围分布。严重危害养猪业的发展。TGEV与猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)在临床症状上很相似，基因组结构上与TGEV 具有较高的同源性，传统的方法很难鉴别。 为了鉴别诊断TGEV与PRCV及对TGEV进行流行病学调查，本研究采用原核表 达系统(GST融合表达系统)表达TGEV纤突蛋白(S蛋白)中含有B和C抗原位点 的多肽，并且制各了非放射性地高辛标记的核酸探针．通过斑点杂交(Dot-Blot)检测 TGEV核酸RNA。 S蛋白可诱导产生中和抗体，是主要的保护性抗原，其N端抗原位点B和C ／rGEV 在pRcv中缺失。根据GenBankTH．98株序列设计第1对引物，应用RT．PCR方法体 外扩增TGEV TH．98株S基因5’端含有B、C抗原位点的片段(ts)，大小为357bp，并 将ts连接到pMDl8．T载体上。序列分析结果为，该片段的核苷酸序列与TGEV其它 99．07％、98．31％，表明该片段在TGEv不同分离株中较为保守。将ts片段亚克隆到原 核表达载体pGEX．6P．1中，将鉴定为阳性的重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3) 后，SDS．PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST大小约为26ku)融合后大小 约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，与理论值相符。优化表达条件后表达量达 379％。 TGEV S基因5’端285bp片段在TGEV分离株中较为保守，与其它冠状病毒同源性 较低。根据GenBank TH．98株序列设计第2对引物，应用RT．PCR方法体外扩增该片 段(命名为tp)，琼脂糖凝胶纯化后测定其浓度和纯度，进行非放射性地高辛标记。对 标记效率测定后，以带正电的尼龙膜为介质进行特异性和灵敏性检测，经非放射性自显 影来显示靶核酸。本研究中探针tp检测到TGEV eDNA最低量为120pg。Lp～一 本研究高效表达了TGEV含有B和C抗原位点的多肽片段(TS)。制备了TGEV 非放射性标记的核酸探针，并初步应用于检测TGEV。二者为TGEV鉴别诊断、血清 学调查奠定了基础。 关键词TGEV：纤突蛋白；核酸探针；原核表达、 TGEV SITES0F OFBANDCANTIGENIC EXPRESSION OF PREPA黜姐10N AND rNPROKARYOCYTE GENE SPIKE PROBEAT5’TERMINUS NUCLEICACID ABSTRACT an diseaseof caused Transmissible enteric pigs by gastroenteritis(TGE)was of