a型口蹄疫病毒构蛋白vplt;,1gt;基因的克隆及其在e.coli中的表达.pdf

5．2．1重组质粒的电泳、PCR及酶切鉴定………………………………·…………………”32 52．2重组质粒的序列分析……………………………………………………………………32 5．2．3重组表达载体的构建和鉴定………………………………·……………·……………·32 5．3表达产物的检测…………………………………………………………………………-·32 5．3．1表达产物的SDS—PAGE分析………………………………………………………………32 5．3．2Western blotting分析…………………………………………………………………33 6讨论……………………………………………………………………………………………37 6．1序歹Ⅱ分析……………………………………………………………………………………37 6．2GST融合表达载体的构建………………………………………………………………”38 6．3VP-基因的表达和检测…………………………·………………………………………··39 6．4包涵体的纯化与复性………………………………………………………………………40 7结论……………………………………………………………………………………………41 参考文献………………………·………………………………………………………………．-42 窝￡ 谢…………………………………………………………………………………………46 插图、附表目录 表1：FMD传统疫苗和基因工程疫苗的优缺点…………………………………………………8 表2：口蹄疫病毒A／FC／72株结构蛋白vPt的核苷酸序列及氨基酸序列……………………33 表3：口蹄疫病毒Fc—vpt株与其它7个A型参考毒株VP-基因核苷酸序列的比较…………35 表4：＆一vp，株与7个A型参考毒株VPl氨基酸同源性比较结果……………………………36 图l：各引物在FMDv基因组上的位置…………………………………………………………20 图2：克隆载体pGE”TEasyVector环形图…………………………………………………24 图3：重组表达载体的构建图……………………………·…………………………………“27 图4：VP。基因的RT-PCR产物电泳图…………………………………………………………34 图5：重组质粒pGEM—FCVP。的鉴定图…………………………………………………………34 P】序列的系统发生树分析结果…………………34 图6：Fc—vp，株与其它7个A型参考毒株v 图7：重组表达质粒pGEX-FCVPt的鉴定………………………………………………………34 图8：表达蛋白的SDS检测结果…………………………………………………………36 图9：Western—blot检测vP1蛋白的表达……………………………………………………37 甘肃农业大学 硕士学位论文 摘 要 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起牛、羊、猪等偶蹄动物感染的一种急性、高度接触性传 极易发生变异，常可导致毒株抗原性及毒力的变化，也是VA蹄疫病毒多型、多亚型的主 要原因，因此vPl在口蹄疫研究中占有重要地位。 本试验从牛舌皮组织中提取总RNA，用设计的特异性引物，采用反转录聚合酶链式 反应法获得了长度约为750bp左右的核酸片段，与预期长度相符。扩增产物连接到 pGEM．T 基因。根据VPl基因核苷酸序列，对A／FC／72株与七个参考毒株进行了系统发生树分析， 扩增鉴定筛选出阳性克隆。测序证明，目的基因正确插入到表达载体，用IPTG诱导VPl blot分析检测，结果表明口 基因的表达，收集不同时间的菌液进行SDS—PAGE和Western 蹄疫病毒结构蛋白VPl在大肠杆菌中能高效表达，并能被口蹄疫A型阳性血清识别。经 凝胶薄层扫描分析表达蛋白约占菌体蛋白总量的30％，表达的目的蛋白的分子量约为 26．3ku。进一步的试验证明表达的目的蛋白以包涵体的形式存在。 关键词：口蹄疫病毒，结构蛋白，VP。基因，克隆，表达 甘肃农业大学 硕士学位论文