人白细胞介素12在哺乳动物细胞中的稳定表达与其生物活性的研究.pdfVIP

人白细胞介素12在哺乳动物细胞中的稳定表达及 其生物活性的研究 焦宏远，詹美云，郭敏卓，伊瑶，丛郁，田瑞光，张文英，毕胜利 【摘要】目的采用遗传基因工程方法获得具有生物活性的入白细胞介素12，探索其治疗肿瘤和 慢性肝炎的可行性。方法采用已克隆的国人JL．12基因序列，利用内部核糖体切入位点(IRES)完成 IL一12 P35、P40双亚基共表达载体的构建，通过转染CHODHFR缺陷细胞，双抗夹心ELISA法筛选阳 性克隆，MTX加压扩增，PCR检测其基因整合，T淋巴细胞增殖和诱生1干扰素实验检测其生物活性。 结果获得了稳定高效表达人IL一12的工程细胞系，表达产物为70x103左右的糖蛋白。结论本研究得到 的基因重组人IL．12具有良好的生物活性，有强的诱导产生1干扰素的能力和诱导活化T淋巴细胞增植 能力。 【主题词】 白细胞介素12；细胞系，哺乳动物；重组蛋白质类 白细胞介素12具有多种生物学活性，是一种重要的免疫调节因子，在感染免疫、肿瘤免疫及自身 免疫疾病中起着非常重要的作用…。动物实验已显示了其强大的广泛抵抗感染性病原体的能力，如HIV、 利什曼原虫、结核杆菌及孽原虫等疾病口1。临床前期实验结果显示，IL一12能增强抗病毒、抗肿瘤活性， 试验㈣。 IL一12是由P35和P40亚基通过二硫键形成的异源双链分子，只有两亚基的共同表达才能产生具有 生物活性的IL一12。蛋白合成过程中需要糖基化修饰，很难在Eco／i中获得有活性的双体形式。我们采 与外源基因共扩增，使外源基因拷贝得到大量扩增，从而显著提高外源基因的表达水平。 1．材料与方法 1．I实验材料 BRL公司；氨甲喋呤MTX 1．1．1主要试剂及工具酶转染用脂质体(Lipofeetin)试剂购于美国Gibco 购于美国Calbiochem公司。抗人IL一12P70单克隆抗体和抗人IL一12多克隆抗体、检{!贝4用生物素化抗体 及亲合素HRP酶标抗体均购自美国RD 公司。 1．1．2质粒和细胞株含有hIL一12 Clontech公司：CH0dhfr一细胞由本室保存。 一304一 1．2主要方法 1．2．1细胞培养，转染和选择培养转染48h后，细胞按一定比例稀传至选择培养基中(不加HT)， 每隔4d换液直到可见明显细胞克隆，待其状态稳定后进行加压筛选。 1．2．2 取细胞培养上清检测IL一12的表达情况。最终选择生长状态良好、稳定高产的细胞株作为克隆细胞系。 1．2．3采用PCR扩增的方法检测转染细胞系染色体基因整合情况Trizol法提取细胞染色体DNA， 在同一PCR扩增体系中，同时加入针对P35及P40的引物，取适量上述细胞染色体DNA作为模板， 通过质粒对照，优化扩增条件，进行双重PCR扩增。 1．2．4Wesiern andreducedSDS B10t检测(non—reduced Page电泳)：收集样品进行非还原性和还原性 SDS—PAGE电泳及Westernblot检测。 1．2．5 T淋巴细胞活化方法按照标准方法分离健康人外周血单个核细胞，Hanks液洗3遍。重悬细胞， d。 1．2．6 测严格按照试剂盒说明书操作。 2．结果 2．1真核细胞表达载体的构建 首先通过PCR方法从已克隆质粒上获得载体构建所需P35、P40cDNA片段，然后通过相应的酶切位 点将IL一12P35和P40亚基分别克隆到plRES的通过IRES相连的多克隆位点MCSA和B上，构建plRES 适于在CHO—dhfr细胞中表达的双顺反子共表达载体。重组质粒采用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定。 2．2高效表达hIL一12的CHOdhfr缺陷型细胞系的建立 2．2．1细胞转染、阳性克隆细胞的筛选和MTX选择性扩增按照常规方法，转染细胞经稀传2—3周后， 可见明显的细胞克隆形成，将单克隆细胞消化后通过有限稀释法将细胞接种到96孔板中，细胞一直在不 加H和T的培养基中生长，以初步筛选抗性克隆细胞。在细胞克隆长到1／4视野时，采用ELISA检测， 共获得7株分泌表达hIL一12P70