备课素材：融合蛋白及其优点-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3.docxVIP

融合蛋白及其优点

先看一道试题：

为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD?构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达?SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-(GTTCCTGGTGTTGGC)50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：

（1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是???????。

答案：EcoRI????HindⅢ

解析：目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应该插入pET-SOD之后，由图可知，需使用的限制酶a和限制酶b分别是EcoRI和HindⅢ。（2）步骤②转化时，科研人员常用??????处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有???????的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是????????(2分）。

答案：CaCl2???卡那霉素??S－F和E－R

解析：将目的基因导入细菌时常用CaCl2?处理，细胞处于感受态；由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50进行PCR技术扩增，需要同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，应选用的一对引物是S－F和E－R可特异性对SOD-ELP50进行扩增。

（3）步骤③大肠杆由中RNA聚合酶与??结合，驱动转录，翻译pET-SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是??????????（从图2的“A~D“中选埴）（2分）。

答案：启动子??C

解析：RNA聚合酶与启动子结合，驱动转录。由图可知，SOD和ELP50对应的基因分别有462bp和750bp，转录出的RNA对应（462+750）/3＝404个密码子，则对应404个氨基酸，其脱水缩合形成的蛋白质相对分子质量约为404×0.11KDa=44.44，电泳后应该为条带C。

（4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。

(i)20°C时，加入NaCl后实验结果是???。

(ii)100°C时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是?????。

(iii)据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有???????(2分）。

答案：（i）SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多?（ii）高温使蛋白质变性??（iii）低温下添加?NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持（2分）

解析：（i）由图可知，20°C时，较不加?NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。（ii）100°C时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。??（iii）20°C时，加入?NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加?NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。

此题是2024年江苏高考题，以荧光蛋白融合基因、融合蛋白的纯化为情境考查构建重组质粒、引物的选择、融合蛋白基因和融合蛋白的表达；蛋白质电泳和纯化等。

1.pET质粒载体

pET质粒载体是一种在基因工程领域中广泛使用的原核表达载体，特别是在大肠杆菌中用于蛋白表达。它具备多个显著特点，使其成为蛋白表达及纯化研究中的重要选择?。

pET质粒载体的主要特点包括：?在表达菌株中能够产生大量的目标蛋白；启动子能够高效地驱动目标基因的转录，从而增加蛋白的表达量；质粒上包含多个常用的限制性内切酶位点，便于不同基因的插入和克隆；有?选择性标记基因?，如抗生素抗性基因，这使得在筛选和维持含有质粒的菌株时更为方便。此外，pET质粒载体还提供了多种不同的版本，如pET-11a、pET-21b等，这些版本在拷贝数、启动子强度等方面可能有所不同，以满足不同的实验需求?。

总的来说，pET质粒载体为科学家在基因工程和蛋白表达研究中提供了便捷、高效的手段。然而，在使用时需要根据实验目的和系统选择合适的质粒载体，并遵循相关的实验操作规程。

2.融合蛋白及其优点

融合蛋白是一种由至少两个结构域组成的蛋白质，这些结构域由单独的基因编码，这些基因已经连接在一起，因此它们作为一个单元被转录和翻译，从而产生一个多肽。现在几乎所有的重组蛋白都是使用融合域（也称为“标签”）制备的