备课素材：DNA片段的扩增及电泳鉴定实验改进+2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3.docxVIP

DNA片段的扩增及电泳鉴定实验改进

DNA片段的扩增及电泳鉴定实验,是高中阶段重的分子生物学实验。《普通高中生物学课程标准2017年版2020年修订)》要求,为帮助学生达成对选择性必修课程“基因工程赋予生物新的遗传特性”概念的理解,促进学生生物学学科核心素养的提升,应开展下列教学活动:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验口。该实验对激发学生科学兴趣、训练学生科学探究能力具有重要意义。

但在实际教学过程中,由于主凝胶孔里加样过程中微量移液器的选择使用、调节量程需要时间以及操作的熟练程度,全部加样完成一

般需要30分钟左右,实验室PCR仪扩增DNA片段30多次循环总时长将近100多分钟,最后电泳也需要30分钟左右后才能观察到结果,实验时间较长的问题影响到该实验在中学的正常开展。

实验原理

1.PCR扩增

PCR是聚合酶链式反应的英文缩写。它是利用DNA半保留复制原理,在体外提供参与复制的组分和条件,进行DNA片段大量复制的技术。DNA分子具有热变性,可以通过调节温度来控制DNA双链的解聚和结合。模板DNA在高温下(90℃-95℃)变性,双链解开,即变性阶段。降低溶液温度,使合成引物在低温(50℃-60℃)与模板DNA互补形成部分双链,即复性(退火)阶段。随后溶液反应温度升至中温(72℃),在TaqDNA聚合酶作用下,以四种脱氧核苷酸为原料,利用两种引物为复制起点,模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链,即延伸阶段。从而实现在同一反应体系中重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环过程,使产物DNA重复扩增。

PCR仪实质上就是一台可以自动调控温度的仪器,一次PCR通常要经历30次左右的循环。

2.电泳

DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH值条件下,可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,带电粒子会向着和它自身所带电荷相反的电极移动,即电泳现象。PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液,在微波炉内加热至琼脂糖完全融化,待冷却后,加人适量的核酸染料混合均匀。将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合均匀,在琼脂糖凝胶上加样后接通电源进行电泳。在凝胶中,DNA分子的迁移速度与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等因素密切相关。

3.鉴定

取出凝胶置于紫外灯下观察并照相。凝胶中的DNA分子经过普通核酸染色后,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。如果使用花青素核酸荧光染料，当染料与DNA嵌合后,借助图谱观察仪能够观察到在可见光(蓝光)激发下发出的黄绿色。

材料与方法

实验准备

教师示范:教师提前到实验室录制好详细实验操作视频,先进行多媒体演示,然后展示关键步骤,让学生学习操作要点,最后再开展分组实验。

器材准备:

全自动基因扩增仪(PCR仪)、电泳仪、水平电泳槽、高速离心机、DNA图谱观察仪、微量可调移液器、吸头及吸头盒、微波炉、冰箱、锥形瓶、制胶板、梳子、量简等。

试剂准备:

极速PCR试剂盒(包含11.6WddH,0、2uL10xBuffer、2uL,Mgcl,、0.8uLdNTImixture、1μ引物|、1L引物Ⅱ、1μ模板DNA、0.6mLTagDNA聚合酶),琼脂糖凝胶电泳试剂盒(包含0.3g琼脂糖、1uL6xLoadingBuffer、luL核酸荧光染料30m1x电泳缓冲液)。

方法步骤

将学生分组,进行以下操作:

①PCR加样

利用极速PCR试剂盒,将部分反应体系预先合好,制成预混液,简化加样流程。混合配制反应体系需在冰上操作。

②使用全自动基因扩增仪(图1)进行DNA扩增:与传统PCR仪不同,全自动基因扩增仪因预先设置好了三个水浴槽的温度,省去了每一轮扩增中温度调节的时间,从而极大节省了实验总时长

③将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混合后加样进行DNA电泳:传统的DNA电泳一般用溴化Z锭(EB)染色,因为EB可插人到DNA碱基对中,两者结合后,经紫外线照射,可发射出红-橙色可见荧光。

此方法虽灵敏快捷,但由于B能够嵌人染色体碱基对,会引起基因突变,有致癌作用,所以有生物安全隐患。本实验采用花青素类核酸荧光染料,可与DNA结合,在可见光的激发作用下发出黄绿色的荧光而被检测到,不仅提高了染色的效率,也确保了实验的安全性和环保性。

④DNA图谱观察,拍照:利用DNA图谱观察仪(图2),在电泳过程中可通过视窗同步直接观察实验结果,无需等电泳结束后再单独观察。

结果与分析

1.不同步骤PCR加样结果

实验结果显示,若按照人教版教材中的七步操作(表1),学生