第六章蛋白质的生物合成.pptVIP

四、原核生物RNA合成1.原核生物RNA聚合酶RNA聚合酶的特性：①细胞均具有RNA聚合酶，E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，它催化RNA主链中核苷酸间的3’,5’磷酸二酯键的形成，在37℃时RNA链的延伸速度可达40nt/s（翻译速率15密码子/s，复制速率800bp/S）；②RNA的合成必须有DNA模板存在，并且要非常精确；③转录作用并没有校正机制。2.原核生物RNA聚合酶的组成（1）原核生物的RNA聚合酶是由ββ’α2?等亚基和2个Zn2+构成的全酶（Holoenzyme），呈椭圆球形结构，全酶可结合约60bp的DNA序列。（2）原核生物中，?、?、?’亚基的大小比较恒定；?亚基变动较大，分子量32kD~90kD，对转录不同的基因RNApol选择不同的?亚基。第30页，共80页，星期日，2025年，2月5日（3）原核生物RNA聚合酶各亚基的功能①β和β’共同组成了酶的催化中心；它们的序列与真核生物RNA聚合酶的最大亚基相关。②β亚基可能是酶和核苷酸底物结合的部位。③利福平（rifampicin）和利福霉素（rifamycin）可与β亚基结合，阻止RNA链的起始（而不影响延伸，它使聚合酶停留在启动子处），从而抑制转录的发生；而链霉溶菌素（streptolydigin）能抑制RNA链的延长，rpoB的突变产生对链霉溶菌素抗性。④β亚基的基因rpoB的突变可使细菌对利福平有抗性。第31页，共80页，星期日，2025年，2月5日⑤β’亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。肝素是一种多价阴子，能与β’亚基结合；因此，肝素能与DNA竞争与RNA聚合酶相结合，从而在体外抑制转录作用；可见β’亚基有较强的碱性，可与模板DNA相结合。⑥α亚基的功能可能是识别其相应的启动子。当T4噬菌体感染E.coli时，其α亚基的精氨酸残基上被ADP-核糖化，修饰作用使RNA聚合酶全酶对其识别的启动子亲和力减弱，所以认为α亚基的功能可能是识别其相应的启动子。⑦?因子的作用：原核生物?因子的功能：帮助核心酶辨认启动子；解开DNA的双螺旋。大肠杆菌有不同的?因子分别转录不同类型的基因，这在基因表达调控中有重要作用。⑧全酶上?亚基结合不牢固，当?亚基脱离后，ββ’α2称为核心酶；核心酶可催化核苷酸间磷酸二酯键的形成。第32页，共80页，星期日，2025年，2月5日（4）原核生物RNA聚合酶基因①E.coliRNApol各亚基的基因存在于3个操纵子中。②细菌的RNA聚合酶远比某些噬菌体特有的RNA聚合酶结构大且复杂，而噬菌体RNA聚合酶仅由一条肽链组成，只能识别噬菌体DNA所有的少数几个启动子，而不能识别其他启动子；它们在37℃时合成RNA速率可达200nts/s。③宿主细胞RNA聚合酶能转录细胞内的任意一个转录单位。这些转录单位中有一些可由RNA聚合酶直接转录，不需要其他因子的帮助；但大多数转录单位需要更多的蛋白质因子存在下才能被RNA聚合酶所转录。④RNApol在体内和体外都是经过4步反应聚集而成。2α→α2、α2+β→α2β、α2β+β’→α2ββ’（核心酶）、α2ββ’+σ→α2ββ’σ（全酶）。3.启动子（Promoter）转录时RNA聚合酶在DNA分子上与启动子识别和结合；启动子是由一些短的保守序列组成的，是DNA上可与RNA聚合酶特异结合并起始转录的部位（序列），位于转录起点附近。第33页，共80页，星期日，2025年，2月5日（1）启动子的分离用足迹法可鉴定并分离出启动子（或其它蛋白），启动子处的核苷酸顺序具有特异性可结合RNA聚合酶。当DNA被RNApol结合时，其覆盖部分不被DNase水解。在适当条件下每个DNA分子中未与蛋白质结合部分的每个磷酸二酯键都被切割一次，切割位置可通过DNA一条链的末端标记来识别。第34页，共80页，星期日，2025年，2月5日（2）Promoter的结构通过足迹法修饰技术，根据游离DNA的对照实验可以知道RNA聚合酶在启动子上结合的位置和序列，可找到RNA聚合酶与启动子的接触位点；结果显示启动子的-35区和-10区包含了与聚合酶接触的大多数位点。比较原核生物的100多个启动子的序列后发现：在RNA转录起始点上游大约-10bp和-35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。-10区：5’-T80A95T45A60A50T96，称Pribnowbox（普里布诺框或普里布诺盒），RNA聚合酶就结合在此部位上。-35区：5’-T82T84G78A65C54A45；