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何首乌毛状根对倍半类化合物的生物转化研究 通过在植物细胞、组织或转化器官等生物体系中添加特定的外源化合物或功能物质，以获得具有价值的各种化学产物的过程，称为植物生物转化技术。由于高等植物中的次生代谢产物量相对很低且有些产物不能或难于通过化学合成途径得到,因此,人们期望能够充分利用植物组织培养以及植物酶对外源底物进行转化,得到目标化合物。其中很多反应具有区域选择性及立体特异性,其反应类型包括氧化反应、还原反应、羟基化反应、甲基化反应、乙酰化反应、异构化反应、糖基化反应以及酯化反应等。 Furannoligularenone属于eremophilane型倍半萜,为菊科橐吾属植物的主要活性成分。该属植物具有止咳化痰、活血化瘀等功效,多种药材的根及根茎用作中药“紫菀”的代用品。 目前用于生物合成/转化的植物培养系统很多,包括愈伤组织(callus)、器官培养、毛状根(hairy root)等。由于毛状根系统具有生长迅速、不需加入外源激素、遗传性状稳定等特点,越来越受到重视。本研究组利用发根农杆菌浸染何首乌Polygonum multiflorumThunb.的无菌苗诱导得到何首乌毛状根,以考察其对倍半萜类化合物的转化能力。 1 材料和方法 1.1 培养瓶、培养液和培养时间 所用培养基为无激素的MS培养基,蔗糖浓度为30 g/L,在消毒前pH调至5.75,分装至250 ml培养瓶,每瓶100 ml,121℃灭菌20 min。控制接种量为每100 ml培养基5 g鲜重毛状根(折合干重约为0.5 g)。25℃振荡暗培养,摇床转速为110 r/min;继代周期为12 d。一般悬浮培养连续继代3次后,获得稳定生长的液体培养体系,可用作生物转化实验。 1.2 基本内容 Furannoligularenone,王乃利教授惠赠,HPLC检测纯度98%。 1.3 底物甲醇溶液的培养 精确控制接种量,往3瓶预培养了9 d的何首乌毛状根培养瓶中分别加入20 mg/ml的底物Ⅰ甲醇溶液0.5 ml,迅速摇匀。同样条件下继续培养。另取3瓶培养物,每瓶加入相同体积的甲醇(不含底物)作为空白对照。 1.4 提取液、培养基 底物加入培养物中,共培养一段时间后,抽滤,分别获得何首乌毛状根培养物和培养基。培养物于55℃条件下烘干至恒重,乳钵研细,称取10 mg粉末于容量瓶中,甲醇定容至5 ml,超声提取1 h后,甲醇补足至刻度;培养基定容至100 ml后,取10 ml,-20℃保存。HPLC分析前,将提取液、培养基经0.45 μm微孔滤膜过滤后用于HPLC检测。同法平行处理对照组培养基和培养物,进行HPLC检测。HPLC检测条件:流动相为55%甲醇-水;流速为1.0 ml/min;柱温25℃;检测波长280 nm;进样量10 μl。 1.5 培养基浸提液制备 将200 mg底物Ⅰ投入预培养9 d的何首乌毛状根中,共培养6 d。抽滤,分别获得培养物和培养基。培养物55℃条件下烘干至恒重,甲醇提取。合并提取液和培养液,减压浓缩,得浸膏。行硅胶柱层析,丙酮:石油醚梯度洗脱;合并产物,甲醇溶解,上Sephadex LH-20柱,甲醇洗脱,经重结晶,得转化产物Ⅱ(8 mg)和Ⅲ(6 mg)。 1.6 底物共培养液制备 精确控制接种量,向18瓶预培养了9 d的何首乌毛状根培养瓶中分别加入20 mg/ml底物甲醇溶液0.5 ml,培养条件同上。分别在共培养1、2、3、4、5和6 d后取出3瓶终止转化。抽滤获得培养物和培养基,处理方法同1.4项。 2 结果与分析 2.1 实验组的结果 比较对照组和实验组的HPLC谱图(图1)可看出,在实验组中存在2个新色谱峰(保留时间tR约为6.2 min和6.8min),结合TLC结果可以初步判定该生物转化是成功的。 2.2 cnmr格局 化合物Ⅱ:C15H18O3,无色针晶,mp:184～186℃。1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.67(dd,J=10.0,2.0Hz,H-1),6.00(dd,J=10.0,3.2Hz,H-2),2.50(q,J=6.8Hz,H-4),2.34(d,J=13.5Hz,H-6a),2.82(d,J=13.5Hz,H-6b),4.93(m,H-8),1.47(dd,J=12.3,1.4Hz,H-9a),2.58(dd,J=13.6,6.8Hz,H-9b),2.91(m,H-10),1.79(t,J=1.71Hz,H-13),0.62(s,H-14),1.12(d,J=6.8Hz,H-15)。13C NMR δ:151.9(C-1),130.2(C-2),202.5(C-3),44.2(C-4),45.0(C-5),35.2(C-6),161.9(C-7),81.5(C-8),37.9(C-9),55.