激光扫描共聚焦显微镜技术9.pptVIP

1）、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。 2）、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。 当前第31页\共有72页\编于星期五\10点 共扼聚焦原理图 当前第32页\共有72页\编于星期五\10点 激光器 扩光器 样品 滤光片 针孔 检测器 入射光 发射光 长通滤光片 当前第33页\共有72页\编于星期五\10点 入射光 发射光 长通滤光片 激光器 扩光器 样品 滤光片 针孔 检测器 当前第34页\共有72页\编于星期五\10点 入射光 发射光 长通滤光片 激光器 扩光器 样品 滤光片 针孔 检测器 当前第35页\共有72页\编于星期五\10点  普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别 当前第36页\共有72页\编于星期五\10点 3）、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。 普通光镜：是在可见光源下一次性成像。 当前第37页\共有72页\编于星期五\10点 当前第38页\共有72页\编于星期五\10点 Z 通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个完整的三维图象 当前第39页\共有72页\编于星期五\10点 当前第40页\共有72页\编于星期五\10点 当前第41页\共有72页\编于星期五\10点 当前第42页\共有72页\编于星期五\10点 当前第43页\共有72页\编于星期五\10点 4）、图像信号及处理： 光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。 当前第44页\共有72页\编于星期五\10点 5、共焦显微镜与传统显微镜的区别 1）.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 当前第45页\共有72页\编于星期五\10点 2）. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片 conventional confocal 当前第46页\共有72页\编于星期五\10点 3）. 增加侧向分辨率  当前第47页\共有72页\编于星期五\10点 4）. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响  当前第48页\共有72页\编于星期五\10点 1）.点照明 2）.具有照明pinhole和探测pinhole 3）.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 4）.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 5）.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 6、激光扫描共焦显微镜的设计特点 当前第49页\共有72页\编于星期五\10点 1）. xy分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜: Rxy=0.61?/NA （0.25 ?m ) Confocal: Rxy=0.4?/NA（0.18 ?m ) 2）. 样品的最大厚度: 取决于: 物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围(166?m、Z-wide) 3）. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm） 取决于: 物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率: 0.35 ?m 7、技术指标（Leica TCS SP2) : 当前第50页\共有72页\编于星期五\10点 4）. 激光器 Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特点: 1) 方向性好: 激光基本延直线传播 2) 单色性好 :??=10-8nm 3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度 集中的。 4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合 当前第51页\共有72页\编于星期五\10点 激光扫描共焦显微镜技术 Laser Scanning Confocal Microscopy Fruit Fly Embryo Nervous System 当前第1页\共有72页\编于星期五\10点 Laser Scanning Co