分子杂交技术详解演示文稿.pptVIP

RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法 1试剂 10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/LEDTApH8.0。 5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚蓝。 甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。 20×SSC； 去离子甲酰胺； 50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl)； 0.1mol/LTris，pH7.5。 当前第62页\共有123页\编于星期五\3点 2步骤 [1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7 ml 10×MSE缓冲液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。　　 [2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。 [3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。　　 [4]55℃加热15min，冰浴冷却。　　 [5]加2 ml 5×载样缓冲液。　　 [6]上样、同时加RNA标记物（同位素（32P）dCTP）。　　 [7]60伏电泳过夜。　　 [8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。　　 [9]室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。　　 [10]室温下将胶浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。　　 [11]20×SSC洗胶1h。　　 [12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。 [13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。 当前第63页\共有123页\编于星期五\3点 在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。 从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。 当前第64页\共有123页\编于星期五\3点 5.3 菌落杂交法 colony hybridization method 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100~200）进行克隆筛选时，可采用本方法。 将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。 主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。 当前第65页\共有123页\编于星期五\3点 当前第66页\共有123页\编于星期五\3点 5.4 噬菌斑杂交法 plaque bybridization 噬菌体为载体进行DNA克隆繁殖时所常用的方法。 把基因组中含有特定碱基序列的噬菌体，通过核酸杂交，从多数噬菌体的噬菌斑中选出的方法。 将在琼脂培养基上形成的噬菌体的噬菌斑，移于硝酸纤维素滤纸上，碱处理使噬菌体DNA变性； DNA固定于硝酸纤维素滤纸上，与用放射性同位素标记的特定的RNA或DNA片段进行杂交； 通过放射自显影法来识别含有所需DNA序列的噬菌体的噬菌斑，并从原来的琼脂培养基中选出与其对应的噬菌斑。 当前第67页\共有123页\编于星期五\3点 当前第68页\共有123页\编于星期五\3点 5.5 斑点杂交 （dot hybridization） 斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。 同一种样品经不同倍数的稀释，还可以得到半定量的结果。 简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因诊断中经常用到，是研究基因表达的有力工具。 目的序列未与非目的序列分离，不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时，难以区分目的序列信号和干扰信号。 当前第69页\共有123页\编于星期五\3点 5.5.1 DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干，密封保存备用。 当前第70页\共有123页\编于星期五\3点 5.5.2 RNA斑点杂交 与DNA斑点杂交类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化） 方法：将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 当前第71页\共有123页\编于星期五\3点 细胞标本处理技术可以简化，不用提取和纯化RNA。方法：用含0