生化-年研究生实验2 PCR检测apoB基因多态性.pptVIP

Mg2+ (1)TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+ (2)不同的酶需不同Mg2+ (3) Taq：Mg2+ 对反应影响很大，1-3 mM终浓度 外界影响： (1) EDTA鳌合Mg2+ 选较低浓度TE(10mM Tris,1mM EDTA)； (2) DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+ 结合， 降低Mg2+有效浓度 如果扩增产物或效率不理想，要注意调整Mg2+浓度 （三） PCR反应条件 PCR循环的温度和时间（变性、退火、延伸） PCR循环的次数和平台效应 （1）变性温度：94-95℃ Templete：GC比例高、长度很长，则变性时间↑ （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于引物Tm值：Tm值=4(G+C) ＋2(A+T) ； 复性温度=Tm值-(5～10℃) ，一般在45～55℃ ； Tm↑退火T↑，Tm↓退火T↓ ； 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3) 延伸：72 ℃ 1min/kb（10kb内） 一般：40－60sec 温度和时间 平台效应 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，引物、底物的消耗、 DNA聚合酶活性下降及非特异性产物的竟争等因素，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，大多数情 况下，平台期(Plateau phase )的到来是不可避免的。 Plateau phase in PCR apoB基因PCR反应体系和反应步骤 体系 25 ?l Mix 12.5 ?l 引物 2 ?l ddH2O 6.5 ?l 模板 4 ?l 步骤 温度 时间 预变性 94 ℃ 5 min 变性 94 ℃ 1 min 退火+延伸 60 ℃ 4 min 延伸 60 ℃ 10 min 35 cycles 循环数 实验二：PCR检测apoB基因多态性 中山医学院生化教研室 实验内容 1、基因PCR（已完成）； 2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳： 1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h； 1 原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。 * 一、DNA琼脂糖凝胶电泳 1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 1 DNA分子的大小：分子量越大，迁移速度越慢； 2 构象：共价闭环DNA分子直线DNA开环双链DNA； 3 凝胶浓度：浓度越大，孔径越小，DNA分子迁移越慢； 4 电压：电压越高， DNA分子迁移越快； 5 缓冲液：碱性环境保证DNA分子带负电荷。 1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 2 实验材料及试剂 琼脂糖 电泳缓冲液：1?TAE（Tris acetate-EDTA buffer ） 6?加样缓冲液 （溴酚蓝/二甲苯青/甘油） EB染色液（溴化乙锭，ethidium bromide） 琼脂糖凝胶板的制备 （封板、制备1.5%的预染或未染的