生化分离工程5亲和纯化.pptVIP

8.2.3 应用举例 1. t-PA的纯化 组织纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种糖蛋白，具有激活纤溶酶原、促进血纤维蛋白溶解的作用，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋白药物。 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和纤维蛋白与t-PA具有亲和结合作用，常用做亲和色谱纯化t-PA的配基。 图5-3是利用精氨酸-Sepharose 4B亲和色谱法纯化猪心组织t-PA的结果。原料为猪心丙酮粉经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀。 图5-3 精氨酸- Sepharose 4B 亲和色谱 2. 干扰素的纯化 干扰素（interferon，IFN） 对癌症、肝炎等疾病具有特殊疗效。 IFN主要分α、β和γ三种类型，可通过动物细胞培养或重组DNA大肠杆菌发酵大量生产。 色素亲和色谱、固定化金属离子亲和色谱和免疫亲和色谱可用于IFN的纯化。 如图5-3是利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大肠杆菌的重组人白细胞干扰素（rhIFN- α）的操作条件和结果。rhIFN- α的比活提高了1150倍，收率达95％。 图5-4 单抗免疫亲和色谱法纯化rhIFN-α 5.3 膜亲和过滤法 自20世纪80年代中期以来，把亲和色谱技术和膜分离技术两种技术有机地结合，出现了膜亲和过滤方法 。 膜亲和过滤方法包括两个分支： 亲和膜分离技术 亲和错流过滤 5.3.1 亲和膜分离 原理和特点 亲和膜（affinity membrane）是利用亲和配基修饰的膜。 亲和膜分离是以亲和膜为亲和吸附介质纯化目标产物的分离方法，是亲和色谱的变型。又称膜亲和色谱（membrane-based affinity chromatography）。 亲和色谱操作速度有限。一般采用径向放大的方式，才能保证色谱柱的处理量。 如果色谱柱的体积一定，降低柱高而增大柱径可即“短粗”型亲和色谱柱有利于提高分离速度。 亲和配基固定在膜孔表面，流体在对流透过膜的过程中目标蛋白质与配基接触而被吸附。 图 5-5 亲和膜吸附原理示意图 应用举例 色素亲和膜纯化G6PDH：在9 min内即完成了0.6 L料液的纯化处理，G6PDH收率达82％，比活提高27倍。 图5-6 色素亲和膜纯化G6PDH 5.3.2 亲和错流过滤 原理和特点 亲和错流过滤（affinity cross-flow filtration，ACFF）又称亲和过滤（affinity filtration）或亲和超滤（affinity ultrafiltration），是生物亲和相互作用与膜分离相结合的生物大分子的分离纯化技术。 亲和过滤操作 图5-7 亲和过滤操作 亲和过滤的优点 ①以压差为传质推动力，速度快，易于放大； ②纯化水平可接近或达到亲和色谱； ③制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快； 与固定床型亲和色谱相比，亲和过滤操作中目标分子与亲和过滤介质的接触在全混槽中进行，最多只能达到一级吸附平衡，相当于色谱过程的一个理论塔板。采用多级串联亲和过滤操作可弥补这一缺点。 应用举例 利用高温杀死的酵母细胞为亲和过滤介质进行亲和过滤纯化con A的研究。 酵母细胞（直径约5 μm）表面含有多糖残基，因此可亲和吸附con A。利用中空纤维膜组件的间歇亲和过滤流程示于图5-8. 0 图5-8 中空纤维膜组件的亲和过滤流程 5.4 亲和双水相萃取 亲和双水相萃取即在PEG或Dextran上接上一定的亲和配基，这样使体系具有双水相处理量大和亲和色谱专一性高的优点。 随着亲和双水相萃取体系的完善，更显示出其在生物物质分离中的独特优点。 近几年来，仅在PEG上可接的配基就有十多种，分离纯化的物质达几十种，产物的分配系数成百上千倍的提高，如用磷酸酯PEG／磷酸盐双水相体系萃取-β干扰素，分配系数由原来的1左右提高到630。 5.5 亲和反胶团萃取 亲和反胶团萃取（affinity-based reversed micellar extraction）是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂（cosurfactant），通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性的分离方法。 图5-9 亲和反 胶团萃取con A 利用正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（octyl-β-D-glucopyranoside，OGP）提高con A的萃取率 5. 亲和纯化 生物亲和作用 亲和色谱 膜亲和过滤法 亲和双水相萃取 亲和反胶团萃取 亲和沉淀 磁性亲和分离 5.1 生物亲和