密度感知信号系统在MRSA感染及红霉素干预作用的研究-重症医学专业毕业论文.docxVIP

大连医科大学硕士学位论文目 大连医科大学硕士学位论文 目 录 一、摘要 1 (一)．中文摘要 一1 (二)英文摘要 ．．3 (三)前言(二)目U舌 ．．55 二、正文 6 (一)材料与方法 6 1．实验材料 ．6 1．1 菌株来源 一6 1．2生物膜载体 ． 6 1．3实验动物 ．6 1．3 主要试剂 ．6 1．4主要仪器 ．6 2．实验方法 6 2．1 分组 6 2．2 ATCC3359 1生长曲线测定 7 2．3红霉素对MRSA最低杀菌浓度测定 7 2．4 MRSA生物膜模型的构建 7 2．5 结晶紫染色法观察生物膜 ．7 2．6 CLSA观察生物膜 ．8 2．7红霉素半成熟生物膜的干预 ． 8 万方数据 大连医科大学硕士学位论文2．8 大连医科大学硕士学位论文 2．8 ELISA检测AIP 8 2．9统计学分析 ．8 (二)结果 ．．9 1．ATCC33591生长曲线 9 2．红霉素对MRSA最低杀菌浓度 ．9 3．生物膜生成曲线 9 4．红霉素对生物膜的干预作用 ．1 0 4．1 红霉素对体外生物膜的干预作用 10 4．2红霉素对体内生物膜的干预作用 12 4．3 红霉素对成熟生物膜的干预作用 12 5．AIP检测结果 13 5．1 AIP自然发展变化 13 5．2细菌上清液中AIP浓度 ．．13 5．3 大鼠血清中AIP浓度 ．．14 6．扩展实验结果 ．15 (三)讨论 1 5 全文结论 23 参考文献 24 三、综述 一29 (～)综述 29 (二)参考文献 35 四、攻读学位期间发表论文情况 ．．36 万方数据 大连医科大学硕士学位论文五、志谢 大连医科大学硕士学位论文 五、志谢 一37 万方数据 大连医科大学硕士学位论文密度感知信号系统在MRSA感染及红霉素干预作用的研究 大连医科大学硕士学位论文 密度感知信号系统在MRSA感染及红霉素干预作用的研究 硕士研究生：史华英 指导教师：万献尧教授 指导小组：李青栋副教授 专业名称：重症医学 摘要 目的：(1)测定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的生长曲线，检测红霉 素对MRSA菌株的最低杀菌浓度，指导后期实验中对细菌接种时间及红霉素应用 浓度的把握。(2)构建MRSA生物膜模型。(3)探究红霉素对MRSA生物膜的破 坏作用以及红霉素对密度感知信号(QS)系统相关因子的影响。 方法：(1)挑取单菌落于5ml TSB培养基中，37。C震荡培养16h后，将细菌 悬液按1：1000接种于TSB培养基中，每2h取出2009l菌悬液于595nm处测量吸 光度值，得到细菌生长曲线；挑取单菌落于5ml TSB培养基中，37。C震荡培养16 小时，调整浓度至108CFU／ml备用；在96孔板中倍比稀释红霉素，将备用的细菌 悬液加入相应孔中，37。C过夜培养，取此细菌悬液509l垂直滴于固体培养基上均 匀涂布，37。C静置24小时，观察菌落生长情况。(2)建立生物膜模型。以聚氯乙 烯(PVC)材质的96孔板作为细菌的粘附载体，以胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)为 液体培养基，将对数后期细菌悬液浓度调整至108CFU／ml后接种于载体上，37。C 静置培养，以结晶紫染色法观察生物膜状态。(3)细菌接种24h后给予红霉素干 预，取作用6h、12h、24h、48h、72h及7d时的细菌上清及大鼠血清，检测QS系 统中的信号传导因子自分泌诱导肽(AlP)的变化趋势。 结果：(1)细菌接种至液体培养基中后，2-一4h为生长适应期，从第4h起已 开始进入对数生长期，持续16h，随后细菌开始进入生长稳定期；红霉素对MRSA 标准菌株的最低杀菌浓度为256mg／L。(2)PVC 96孔板经结晶紫染色可见孔壁气 液交界处一层紫色连续性片状生物膜。(3)细菌接种24h后给予红霉素或TSB干 预，短时间内生物膜有减少趋势，随后又逐渐增加，最终稳定存在，但实验组生 物膜整体水平低于TSB组。(4)生物膜发展成熟后弃去细菌悬液，予红霉素或TSB 直接作用于生物膜，可见从48h开始，两组出现不同的发展趋势，实验组生物膜 逐渐减少，最后基本完全消散；而TSB组生物膜初始减少后又增多，两组具有显 万方数据 大连医科大学硕士学位论文著性差异。(5)细菌接种后不同时间段给予红霉素干预，只有3h之内干预可有效 大连医科大学硕士学位论文 著性差异。(5)细菌接种后不同时间段给予红霉素干预，只有3h之内干预可有效 杀菌，且无生物膜形成。(6)AIP的发展趋势相似于并且早于生物膜的发展趋势。 (7)给予红霉素干预后AIP的合成或分泌减少。 结论：(1)以PVC材料为粘附载体可成功构建MRSA生物膜模型。(2)在细 菌未形成生物膜时及时给予红霉素干预，可以有效杀菌；红霉素可以破坏已形成 的生物膜。(3)AIP是促进生物膜形成的重要