第十章 转基因动物与生物反应器PPT.pptVIP

* *  第 十 章 转基因动物与生物反应器 10.1转基因技术 基因工程技术： 按照人们的意愿，重组DNA（一种生物DNA中的遗传密码片段连接到另一种生物的DNA链上），设计新的遗传物质，创造新的物种。 转基因技术：通过人工操作的方法将外源基因整合到生物体基因组内，使该转基因生物能稳定地表达并将此基因遗传给后代的实验技术。 10.1.1 细胞转染外源基因的方法 常用的哺乳动物细胞转染（接受外源基因）的方法有两种： 1.? 暂时转染：质粒在宿主细胞内不必停留很长时间，DNA转录成mRNA，翻译成蛋白质，并不进入基因组。如磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体载体发等。 2.? 永久性转染：逆转录病毒载体法可产生永久有效的转染。 10.1.1 细胞转染外源基因的方法 基因转移的方法：物理、化学和生物方法。 一、物理方法 1.电穿孔法： 利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔。从而使外源DNA不经过胞饮作用直接转移至细胞中。 2.微注射法：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，处死雌鼠取出受精卵。借助显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄核内，将受精卵移植到另外一只假受孕的母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。 10.1.1 细胞转染外源基因的方法 3.裸露DNA直接注射法 将裸露DNA直接注射到组织中，DNA有可能直接被细胞所摄入。 最简单，但效率低。 三、生物学方法： 病毒介导的基因转移。常用的病毒载体包括DNA病毒载体、逆转录病毒载体等。 ? 反转录病毒载体可稳定、长期表达外源基因。载体通常含有一个选择性标记和要表达的外源基因。由于病毒的大部分结构基因已经被除去，这种载体不能自我复制。将克隆的原病毒DNA转染进包装细胞中产生病毒原种，病毒原种缺少复制功能，但能感染培养靶细胞，从而有效地诱导出重组基因组，即反转录出DNA，并插入细胞基因组中。 但病毒载体有缺陷： 所有病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应；或多或少存在安全隐患； 转导能力有限，不适合大规模生产。 10.1.2 转染细胞的鉴定 可设计含有抗药性基因的外源DNA载体，然后通过选择性培养基进行转染细胞的筛选。 也可通过提取转染细胞的DNA，以适当限制性内切酶酶切后进行Southern转移分析，检验细胞中是否有被转移的外源基因。 10.2 转基因动物 转基因动物（transgenic animal）： 在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地表达和遗传给后代的遗传工程动物。 10.2.1 发展历史 1974年，贾英利斯和明茨应用显微注射法，在世界上首次获得AV40DNA转基因小鼠。 1980年，戈登等人首次育成带有人胸苷激酶基因的转移小鼠。 1982年，帕尔米特等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得比普通对照小鼠生长速度快2~4倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”。 随后的几十年里，转基因动物技术飞速发展。 10.2.2 转基因动物的制备 一、原理与方法 生产转基因动物的关键技术： 外源目的基因制备； 外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞； 选择获得携有目的基因的细胞； 选择合适的体外培养系统和宿主动物； 转基因细胞胚胎发育及鉴定； 筛选所得的转基因动物品系。 10.2.2 转基因动物的制备 方法： 1.? 原核期胚胎显微注射法 2.? 反转录病毒感染法 3.? 胚胎干细胞方法 4.? 精子载体法：精子与DNA混培养，精子携带DNA进入卵子 5.? 人工酵母染色体法：百万碱基对的巨大基因，整合率较高 6.? 受精前卵细胞显微注射法 7.? 其他方法：电脉冲法、染色体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰击法、基因剔除、基因嵌入等 3种转基因的方法及其与发育阶段的关系： DNA 反转录病毒感染或DNA转染或电转移 胚胎干细胞 显微注射 囊 胚 受精卵 四细胞期 原肠胚 转基因动物 DNA 显微注射 DNA 反转录病毒感染 转基因动物鉴定技术： 早期采用的、也是目前最有权威性的转基因动物鉴定技术是Southern blot。提取待检动物组织的染色体消化后电脉，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影